降糖益腎丸對糖尿病腎病大鼠腎Toll樣受體4和炎癥因子的影響

謝 瑜，楊 蕙，雷 昌，廖小娟*，王 青，聶孝平，鄒菊英，崔 姣，王艾琳

(1.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫藥大學 科技創新中心/湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208)

炎癥因子的募集和激活在促進DN腎損傷發展進程中發揮著主要的介導作用[1]。DN患者體內的炎癥水平隨病程進展而加重，通過炎性介質及炎癥信號通路介導腎小球內皮細胞損傷并最終導致腎小球硬化[2]。TLR4(Toll-like receptors 4，TLR4)能識別內源性配體并激活NF-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，導致促炎細胞因子的合成和分泌，持續參與DN的炎癥反應，研究表明，在DN炎癥反應中下調TLR4可抑制JNK/NF-κB通路，減少促炎細胞因子IL-6、IL-1α、IL-8和TNF-α的釋放，抑制TLR4/NF-κB信號通路及其促炎細胞因子的產生，對炎癥性腎損傷具有保護作用[3-4]。前期臨床研究證實，降糖益腎丸可明顯改善瘀毒損傷腎絡型DN早期患者的臨床癥狀、體征，改善尿微量白蛋白排泄率，能明顯延緩DN腎損傷的發生與發展[5]。然而降糖益腎丸治療DN的確切機制不清楚，阻礙了進一步的開發和應用。因此，本研究探討該藥是否通過調控腎小球細胞TLR4/NF-κB炎癥通路的表達降低DN大鼠的腎炎癥水平，進而發揮保護腎小球炎癥損傷作用。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠36只，體質量(300±20) g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0014；飼養籠具、墊料、普通飼料、飲水均按SPF級實驗動物的要求進行制備與消毒，高脂高糖飼料購自長沙市天勤生物技術有限公司；自由攝食與飲水適應性飼養3天后開始實驗。

1.2 試藥

降糖益腎丸(湖南中醫藥大學第二附屬醫院制劑室生產，批號：20200407)。鹽酸二甲雙胍(石家莊以嶺藥業股份有限公司，規格0.25 g，批號：A2011056)，厄貝沙坦(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，規格0.15 g，批號：201110JB)。

1.3 儀器與試劑

AE224型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；5804R離心機(德國Eppendorf公司)；GA-3型血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)；MK3型酶標儀(美國Thermo公司)；SE-150高速粉碎機(永康市圣象電器有限公司)。鏈脲佐菌素(STZ，S17049，18883-66-4 USP級，98.5%，上海源葉生物技術有限公司)；滅菌注射用水(石家莊四藥有限公司，批號：2005203201)，其余實驗用水為重蒸餾水；羧甲基纖維鈉(CMC-Na，批號：200401，安徽山河藥用輔料股份有限公司)；MB-1762B大鼠Toll樣受體4(TLR4)、NF-κB p65 酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號：2021053106，江蘇酶標生物科技有限公司)；IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)。

1.4 動物造模、分組及給藥

36只SD大鼠按照體質量隨機分為模型組30只，空白對照組6只?？瞻讓φ战M給予普通飼料喂養3天后，按體質量換算后予單次腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。除空白對照組外其余大鼠給予高脂高糖飼料+飲水飽和適應性喂養3天后，予單次腹腔注射STZ 60 mg/kg(STZ臨用前用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解，pH=4.5，4 ℃，配制成1%STZ溶液，避光冰浴中進行)。72 h后，尾靜脈采血，用快速血糖儀測空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)，FBG穩定于16.7 mmol/L及以上，列入觀察對象。同時用尿糖試紙測定尿糖，尿糖強陽性，繼續給予高脂高糖飲食8周，24 h尿蛋白定量≥30 mg/dL/24 h，即提示糖尿病腎病造模成功[6-7]。

造模成功后大鼠隨機分為5組，每組6只：DN模型組、DN模型+降糖益腎丸組(高劑量組)、DN模型+降糖益腎丸組(中劑量組)、DN模型+降糖益腎丸組(低劑量組)、DN模型+鹽酸二甲雙胍+厄貝沙坦組。分組后開始給藥，每日定時灌胃1次，空白對照組、DN模型組給予等體積蒸餾水，連續給藥4周。降糖益腎丸按成人等效劑量換算成大鼠每日灌胃劑量為低劑量組(1.35 g/kg/d)、中劑量組(2.7 g/kg/d)、高劑量組(5.4 g/kg/d)。陽性藥鹽酸二甲雙胍180 mg/kg/d、厄貝沙坦27 mg/kg/d。各組大鼠均于相應給藥4周后收集血清、腎組織樣本保存，備用。

1.5 指標檢測

給藥結束后，分別對各組大鼠進行血液采集，血漿注入含有10%乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉的離心管里，混勻后在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上層血清樣品于-80 ℃冰箱中保存，備用。取血后處死各組大鼠，于冰上摘取腎臟，剝離腎包膜，濾紙吸干血跡后，將各腎樣本取出切割，分別稱取適量，進行冰浴上勻漿；3 000 r/min低溫離心15 min，收集上清，分裝后一份待檢測，其余用液氮迅速冷凍，于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.5.1 血清炎性因子IL-6和TNF-α的含量檢測 將各組大鼠血樣取出靜置，解凍融化后保持 2～8 ℃的溫度，3 000 r/min離心15 min，取上層血清轉移，分裝備用。檢測嚴格按照酶聯免疫(ELISA)試劑盒說明書進行。

1.5.2 腎TLR4、NF-κB p65的含量檢測 將各組大鼠腎樣本取出切割后，分別稱取1 g，選用組織勻漿器，加9 mL的勻漿液來進行冰浴上勻漿(0.1 g/mL)。勻漿液選取PBS(pH=7.2～7.4，濃度為0.01 mol/L)；3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，分裝后待檢測。檢測嚴格按照酶聯免疫(ELISA)試劑盒說明書進行。

1.6 數據處理

對各組相應指標的原始數據用均數±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析；方差齊者采用LSD(L)法進行統計學分析，方差不齊者用Tamhane檢驗，組間兩兩比較用q檢驗。采用雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α表達比較

與對照組比較，模型組大鼠IL-6、TNF-α表達均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥組與中、高劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達均顯著下降，低劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達亦下降(P<0.01或P<0.05)。與中、高劑量組比較，低劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達顯著升高(P<0.01)。與陽性藥組比較，中、高劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達亦升高，低劑量組大鼠IL-6、TNF-α表達顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子表達比較

2.2 各組大鼠腎TLR4和NF-κB p65表達比較

與對照組比較，模型組大鼠TLR4、NF-κB p65表達均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥組與中、高劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65表達均顯著下降，低劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65表達亦下降(P<0.01)。與中、高劑量組比較，低劑量組TLR4、NF-κB p65表達顯著升高(P<0.01)。與陽性藥組比較，中、高劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65表達亦升高，低劑量組大鼠TLR4、NF-κB p65表達顯著升高(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠腎TLR4和NF-κB p65表達比較

3 討論

DN屬中醫學“消渴”范疇，消渴日久，熱灼津虧，傷陰耗氣，氣陰兩虛。氣虛血運無力則澀滯，滯而成瘀，氣血失調致氣陰更虛，血脈更瘀。血瘀內阻，阻礙三焦水道運行[8]?！稘健费裕骸跋手?，皆起于腎。”腎居下焦，水濕內聚，濕邪重濁黏膩，易于化熱，明代醫家吳昆在《醫方考》中云：“下焦之病，責于濕熱?！彼疂癫换?，焦灼津液，津液失于運化，瘀血內生，瘀阻腎絡。久瘀腎絡膠結化毒，毒邪阻絡，瘀毒互結內蘊，毒邪傷絡，毒損腎絡[9]。因此，DN基本病機為“虛、瘀、毒”，以益氣養陰、化瘀解毒論治。本研究采用降糖益腎丸(本院制劑，批準文號：湘藥制字Z20080821)以化瘀解毒為重要治則，控制DN癥狀療效確切，在多年臨床應用中無不良反應，安全性高。方中生地、山藥益氣養陰，為本方之君藥；丹參、丹皮活血化瘀，黃芩、黃連除濕清熱解毒，均為臣藥，配合君藥以活血化瘀、泄濁解毒；諸藥合用，通過對人體氣血津液的調整而達到“陰平陽秘”，共奏益氣養陰、化瘀解毒之功[5]。瘀毒損傷腎絡貫穿DN的發生發展過程始終，早期表現為腎小球毛細血管數量增加，GECs數量增多、腫脹、功能受損，導致血管滲透性增加，血漿蛋白漏出，與腎絡受損的中醫理論相符合[10]。炎性因子屬中醫“毒邪”范疇[11]。DN“毒”的特征性為腎組織內高度表達的單核細胞趨化因子、NF-κB等細胞因子的變化，與中醫學提到的消渴病日久不愈、臟腑功能失調，導致瘀、熱、濕等病理產物瘀阻血脈而成的“毒”具有相似性[12]。

本研究采用的降糖益腎丸所含丹參藥味能有效降低高糖誘導大鼠腎細胞TLR4蛋白表達，下調TLR4/NF-κB信號通路并降低下游相關信號分子表達，對糖尿病狀態下的大鼠腎組織有保護作用[13]。方中黃連能降低鏈脲佐菌素(STZ)所致DN模型大鼠的糖化血紅蛋白、血清TNF-α含量，抑制腎臟NF-κB表達及增強過氧化物酶增殖物受體-γ(PPAR-γ)mRNA表達緩解糖尿病腎臟病變[14-15]。方中君藥生地的主要有效成分環烯醚萜苷梓醇可緩解DN的蛋白尿，通過調節TLR4/MyD88和p38MAPK信號傳導途徑阻止NF-κB活化，改善炎癥損傷[16]。

綜上所述，以化瘀解毒為重要治則的降糖益腎丸治療瘀毒損傷腎絡型DN有效，能顯著降低DN大鼠的腎炎癥水平，其作用可能與下調TLR4和NF-κB p65、IL-6、TNF-α等炎性因子表達相關。