三葉青HPLC指紋圖譜研究及多成分含量測定

李士敏，劉京驊，楊穎欣，孫崇魯，張煜炯

(浙江藥科職業大學，浙江 寧波 315100)

三葉青(TetrastlgmahemsleyanumDiels et Gilg.)為葡萄科崖爬藤屬，是我國特有草本植物，2018年2月入選新“浙八味”，成為重點培育品種。中醫學認為三葉青具有清熱解毒、活血止痛等功效，內服對小兒高熱驚厥、肝炎、扁桃體炎等療效顯著；外用可治毒蛇咬傷、跌打損傷等[1]。三葉青作為民間用藥，目前尚未被國家標準收錄，但浙江省中藥飲片炮制規范(2015年版)將其收載，該質量標準中將浸出物含量作為定量質量控制指標。

有研究報道，三葉青中富含黃酮、多酚、多糖、有機酸類等，以及Mg、Fe、Mn等多種微量元素[2-7]。目前針對三葉青質量評價的研究主要集中于黃酮類或酚酸類成分的含量測定[8-10]，而對不同種類化學成分、不同產地三葉青的質量比較研究較少。當前，指紋圖譜結合多組分含量測定方法已廣泛應用于中藥材的質量控制、來源分析及差異標記物篩選等方面[11-13]。基于此，本研究采用HPLC法，建立三葉青HPLC特征指紋圖譜，并對其中山柰酚(KA)、紫云英苷(AS)、槲皮素(QU)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(KR)(黃酮類)、綠原酸(CA)(有機酸類)、白藜蘆醇(RE)(多酚類)以及虎杖苷(PO)(醌類)等7種活性成分含量進行測定，為三葉青藥材質量控制指標的建立與整體質量控制提供參考。

1 儀器與試劑

儀器：Agilent高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Agilent公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水儀(美國CASCADA公司)；萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；中藥粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)。

試劑：甲醇、乙腈(HPLC級，美國TEDIA公司)；CA(含量≥99.4%，批號：20100210)、AS(含量≥98.0%，批號：20022087)、PO(含量≥99.8%，批號：20100216)、RE(含量≥99.9%，批號：20021134)、KR(含量≥98.0%，批號：20100411)、QU(含量≥98.5%，批號：18022608)、KA(含量≥98.0%，批號：18100261)7種對照品均購自上海源葉生物科技有限公司；三葉青樣品產于云南、貴州、重慶、湖南、廣西、浙江和福建等地(樣品信息見表1)，所有樣品經浙江醫藥高等專科學校彭昕博士鑒定為葡萄科崖爬藤屬三葉青(TetrastlgmahemsleyanumDiels et Gilg.)的塊根。

表1 不同產地三葉青樣品信息

2 方法

2.1 樣品溶液制備

精密稱取樣品粉末(過60目篩)1.0 g，加甲醇(80%，V/V)25 mL，超聲(300 W，40 ℃)提取60 min，濾過，濾渣用同濃度甲醇25 mL重復提取1次，合并提取液，水浴濃縮至10 mL，經0.45 μm濾膜過濾，備用。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取7種對照品適量，用甲醇溶解，制得CA濃度為1.06 mg/mL，PO濃度為1.21 mg/mL，KR濃度為5.4 mg/mL，AS濃度為2.36 mg/mL，RE濃度為0.62 mg/mL，QU濃度為8.3 mg/mL，KA濃度為0.89 mg/mL的混合溶液。置于4 ℃冰箱中保存，備用，臨用前經0.45 μm濾膜濾過。

2.3 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18柱；流動相組成為A相：乙腈，B相：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫：0 min，10%乙腈；0～30 min，10%～30%乙腈；30～40 min，30%～95% 乙腈；40～45 min，95%乙腈；45～60 min，95%～10%乙腈；流速：0.8 mL/min；檢測波長320 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。上述條件下，CA、PO、KR、AS、RE、QU、KA等7種成分分離良好(見圖1)。

注：1.綠原酸；2.虎杖苷；3.山柰酚-3-O-蕓香糖苷；4.紫云英苷；5.白藜蘆醇；6.槲皮素；7.山柰酚。

2.4 方法學考察

2.4.1 重復性試驗 按“2.1”項下方法制備樣品 6 份，按“2.3”項下色譜條件測定CA、PO、KR、AS、RE、QU及KA的峰面積，計算其峰面積的RSD分別為1.5%、1.1%、1.6%、1.8%、1.6%、1.3%、0.94%，表明本方法的重復性良好。

2.4.2 穩定性試驗 按“2.1”項下方法制備供試品溶液。在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.3”項下色譜條件測定CA、PO、KR、AS、RE、QU及KA的峰面積，7種活性成分峰面積的RSD分別為1.9%、1.4%、1.5%、1.6%、1.5%、1.5%、1.8%，表明供試品在24 h內穩定。

2.4.3 精密度試驗 取“2.2”項下的混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件重復進樣6 次，記錄CA、PO、KR、AS、RE、QU及KA的峰面積，結果7種對照品峰面積的RSD分別為1.0%、0.9%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.0%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 線性關系考察 取“2.2”項下制備的對照品溶液適量，用甲醇稀釋至不同倍數，搖勻，分別取10 μL注入高效液相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件進行測定，以混合對照品濃度為橫坐標(X)，測得的峰面積作為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，計算得回歸方程及相關系數見表2。

表2 7 種成分的線性關系及線性范圍

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的三葉青樣品粉末1.0 g，平行6份，按“2.1”項下方法制備樣品溶液，精密加入“2.2”項下的混合對照品溶液適量，按“2.3”項條件測定。計算平均回收率(見表3)，結果表明方法加樣回收率良好。

表3 回收率試驗結果

2.4.6 含量測定 按“2.1”項下方法制成供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.3”項條件測定，含量測定結果見表4。

表4 13批三葉青藥材中7 種成分的質量分數 (n=2)

2.5 三葉青HPLC 指紋圖譜分析

2.5.1 HPLC-UV特征圖譜建立 將13 批三葉青樣品，按“2.1”項下方法，制備供試品溶液，按“2.3”項下方法測定，記錄色譜，將色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(國家藥典委員會2012版)，選定S-1號樣品色譜為參照圖譜，設定時間漂移值為0.1，采用平均數法譜峰多點矯正生成三葉青對照圖譜，疊加圖譜及對照圖譜(見圖2)，將該對照圖譜的相似度值定為1，計算不同產地樣品特征圖譜的相似度。

圖2 不同產地三葉青HPLC指紋圖譜

2.5.2 共有峰的確認與歸屬 對色譜圖進行整體分析，共標識出17個共有峰，共有峰的峰面積之和大于85%。對照確認對照品出峰時間，確定其中2號峰為CA，10號峰為PO，11號峰為KR，12號峰為AS，14號峰為RE，15號峰為KA。

2.5.3 相似度分析 將13批三葉青樣品與生成的對照指紋圖譜相比較，各批次三葉青樣品的相似度在0.537～0.986之間，樣品S3、S5、S10、S12相似度在0.8以下；樣品S4、S6相似度在0.9以下；其余樣品相似度在0.9以上。見表5。

表5 13 批三葉青相似度分析結果

3 討論

3.1 色譜條件優化

流動相組成：考察甲醇、乙腈和水不同組合洗脫下的分析結果，結果顯示乙腈與水組成的流動相洗脫效果更好，得到的色譜圖色譜峰數目最多。當在水相中加入少量磷酸后，色譜峰分離效果變得更好，采用乙腈-0.1%磷酸水溶液按梯度洗脫時，基線波動較緩，各成分色譜峰保留時間適中且數量最多。故流動相組成確定為乙腈-0.1%磷酸水溶液。

檢測波長選擇：7種對照品溶液均為無色，故實驗采用DAD檢測器在200～400 nm波長范圍內進行掃描發現，7種對照品溶液在320 nm波長下測定吸光度最大，且在此波長下供試品溶液的色譜峰數目最多，因此選擇320 nm作為檢測波長。

3.2 樣品含量測定結果及分析

含量測定結果顯示，三葉青中7種活性成分含量差異較大，AS含量在0.010～0.097 mg/g之間，QU含量在0.004～0.266 mg/g之間，KR含量在0.039～0.929 mg/g之間，CA含量在0.010～0.143 mg/g之間，RE含量在0.003～0.129 mg/g之間，KA含量在0.001～0.046 mg/g之間，PO含量在0.001～ 0.065 mg/g之間。現代藥理學研究表明，AS有抗炎、抗氧化和保護心肌的功能[14]。QU具有抗抑郁、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、免疫抑制、神經保護等多種藥理學活性[15]。KA及其衍生物KR具有抗炎、抗氧化、抗驚厥、抗抑郁、抗癡呆，以及對缺血腦組織的保護作用等多種生物學活性，而其神經保護作用尤為關注[16]。CA具有抗炎、抗氧化、抗微生物等多種生物活性[17]。PO具有抗血栓、抗動脈硬化、改善心肌損傷、抗休克以及調節糖脂代謝等多方面的藥理活性[18]。RE對非酒精性脂肪性肝炎、糖尿病等代謝性疾病具有保護作用[19]。從整體看，13批樣品中，KA和PO含量較低，而KR、CA、RE和AS的含量差異較大；從單個化學成分看，三葉青中AS、QU、KR等7種化學成分的含量差異很大，這可能是受采集時間的影響所致[20]。

本研究建立了三葉青的HPLC指紋圖譜，并建立了7種活性成分的含量測定方法，可用于三葉青藥材質量評價或其制劑質量控制。