UPLC法測定覆盆子中科羅索酸和齊墩果酸的含量

李 靜，朱婉萍，王昱霽

(1.浙江中醫藥大學 藥學院，浙江 杭州 310053；2.椒江綠康老年康復護理院，浙江 臺州 318000；3.浙江省中醫藥研究院，浙江 杭州 310007)

覆盆子為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物華東覆盆子的聚合果[1]。作為中藥材，覆盆子具有益腎固精縮尿、養肝明目等功效，臨床用于治療遺精滑精、遺尿尿頻、陽痿早泄、目暗昏花等癥狀[2]。現代研究證明，覆盆子含有多糖、萜類、糖蛋白、黃酮、甾醇、生物堿、香豆素和酚酸等化合物[3-8]，已明確有活性的成分包括鞣花酸、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、β-谷甾醇、齊墩果酸、覆盆子素、槲皮素等。目前未見到有學者對其活性三萜類成分科羅索酸和齊墩果酸進行UPLC的含量測定，作者對覆盆子中的科羅索酸和齊墩果酸成分進行方法學驗證，并對不同產地的覆盆子進行相關含量測定，為覆盆子的質量控制提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

超高壓液相色譜儀：Waters UPLC H-Class；分析天平：Sartorius，BT 25 S；分析天平：Mettler Toledo，MS204S；超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司，SB-52000。

1.2 試藥

科羅索酸(98%，CX0060，江蘇永健醫藥科技有限公司)；齊墩果酸(91.6%，200167-190302，江蘇永健醫藥科技有限公司)；乙醇(分析級：成都市科隆化學品有限公司，2019050902)；甲醇(色譜級：Merck，I837107623)；磷酸：(分析級：成都市科隆化學品有限公司，2019010201)；覆盆子樣品(浙江臺州的采摘自浙江臺州華宇農場掌葉覆盆子基地)，其他的覆盆子樣品采購自多個藥材市場，經浙江中醫藥研究院鑒定為薔薇科植物華東覆盆子(RubuschingiiHu)的果實。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

使用UPLC測定，色譜柱 Waters UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流動相甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫，梯度洗脫變化見表1；檢測波長為210 nm；進樣量2 μL；流速0.4 mL/min；柱溫35 ℃。科羅索酸、齊墩果酸與相鄰色譜峰的分離度應大于1.5，理論塔板數應不低于3 000，色譜見圖1。

表1 科羅索酸、齊墩果酸梯度洗脫程序

注：科羅索酸出峰時間：3.446；齊墩果酸出峰時間：4.806。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取科羅索酸標準品1.66 mg、齊墩果酸標準品2.37 mg，于10 mL量瓶甲醇定容，制成含科羅索酸0.166 mg/mL、齊墩果酸0.237 mg/mL的對照品溶液。

2.3 樣品溶液制備

取過四號篩的覆盆子干燥樣品粉末2 g，精密稱定，加甲醇60 mL，稱重，超聲1 h，至室溫后用甲醇補足失重，搖勻，濾過。濾液減壓蒸干，稱取適量提取物用甲醇溶解并于10 mL量瓶定容，配制成濃度約為4 mg/mL的供試品液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 分別精密量取科羅索酸、齊墩果酸對照品溶液0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、2.5 mL、5 mL置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容，用0.22 μm微孔濾膜過濾后即得混標供試品。按“2.1”項下項色譜條件，UPLC進樣量2 μL，檢測并記錄譜圖及峰面積，以濃度為橫坐標(x)峰面積為縱坐標(y)進行回歸。得科羅索酸標準曲線：y=907 961.402 8x+336.881 3，R2=0.999 4，見表2、圖2；齊墩果酸標準曲線：y=1 191 439.354 7x-1 105.288 0，R2=0.999 7，見表3、圖3。分別在0.001 627～0.081 34 mg/mL、0.002 171～0.108 6 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

表2 科羅索酸對照品濃度與峰面積數據

圖2 科羅索酸標準曲線

表3 齊墩果酸對照品濃度與峰面積數據

圖3 齊墩果酸標準曲線

2.4.2 精密度試驗 取科羅索酸、齊墩果酸對照品溶液0.4 mL，置于2 mL量瓶中用甲醇定容，0.22 μm微孔濾膜過濾后按“2.1”項色譜條件，連續進樣6次，得科羅索酸峰面積的RSD為0.79%，齊墩果酸峰面積的RSD為1.5%，表明儀器精密度良好，見表4。

表4 科羅索酸、齊墩果酸精密度試驗結果

2.4.3 重復性試驗 精密稱定同一過四號篩的覆盆子樣品粉末6份，按“2.3”項下制備供試品液，按“2.1”項色譜條件進樣，得科羅索酸提取物含量的RSD為1.710%，齊墩果酸提取物含量的RSD為1.609%，表明該方法重復性良好，見表5。

表5 科羅索酸、齊墩果酸重復性試驗結果

2.4.3 重復性試驗 精密稱定同一過四號篩的覆盆子樣品粉末6份，按“2.3”項下制備供試品液，按“2.1”項色譜條件進樣，得科羅索酸提取物含量的RSD為1.710%，齊墩果酸提取物含量的RSD為1.609%，表明該方法重復性良好，見表6。

表6 穩定性試驗結果

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的覆盆子粉末6份，每份約1 g精密稱定，分別加入科羅索酸、齊墩果酸適量，加甲醇30 mL，其他按“2.3”項下操作，制備供試品液，按“2.1”項色譜條件進樣，得科羅索酸含量的RSD為1.924%，齊墩果酸含量的RSD為1.722%。所得結果見表7。

表7 加樣回收率試驗結果

2.4.6 樣品含量測定 精密稱定不同產地的覆盆子樣品，打粉，過四號篩，按“2.3”項下制備不同產地的覆盆子供試液，按“2.1”項色譜條件進樣，測定科羅索酸、齊墩果酸含量，結果見表8。

表8 不同產地覆盆子中的科羅索酸、齊墩果酸含量 (μg/g)

3 討論

3.1 檢查對象的選擇

覆盆子中的三萜類物質具有多種藥理活性，作者希望能建立覆盆子藥材中科羅索酸和齊墩果酸的UPLC含量測定方法，控制其質量，為種植研究及工藝研究提供依據。

3.2 色譜條件的選擇

在參考文獻[9-11]的基礎上先進行HPLC的試驗，因保留時間長，改用UPLC進行，希望改進試驗速度。流動相的選擇，分別進行了甲醇、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-水作為流動相進行相關試驗，結果顯示，甲醇-0.2%磷酸溶液的分離度最好，效果最佳。柱溫選擇，因柱溫對科羅索酸和齊墩果酸的分離度影響不大，最終選擇了35 ℃作為色譜柱的柱溫。檢測波長的選擇，根據文獻結果，對波長進行復查，最終選取響應值最大的210 nm作為測定波長。流速的選擇，分別進行了1、0.8、0.6、0.4 mL/min的流速試驗，結果顯示，0.4 mL/min的流速分離度適中，用時最短。流動相梯段時間的選擇，對流動相梯度進行多個時間設定的對比，選擇能有效去除雜質，并且保持合適目標分離度的梯度時間，結果顯示使用正文中的流動相，分離效果最佳。

3.3 提取條件的選擇

在提取方法上，分別對覆盆子進行了超聲提取和加熱回流提取的比較，以含量為考察指標，結果表明，超聲提取得到的科羅索酸、齊墩果酸含量更高。在提取溶劑的選擇上，參考曹富等[11]的研究，選擇了提取效率較高的甲醇作為提取溶劑。提取工藝的選擇考慮取溶劑濃度、醇提次數、提取時間、加醇量等因素的影響，參考制劑提取工藝的L16(45)正交試驗結果，以及標準曲線的定量限范圍，確定“2.3”項下的樣品溶液制備方法。

4 結語

試驗采用UPLC法同時測定覆盆子萜類成分中科羅索酸和齊墩果酸的含量，為建立覆盆子的質量控制提供依據。該檢測方法可以有效測定不同產地覆盆子中科羅索酸和齊墩果酸的含量，檢測結果分別在0.001 627～0.081 34 mg/mL、0.002 171～0.108 6 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。該方法靈敏、便捷、準確、穩定，可用于覆盆子藥材的質量評價。