柳枝藥材質量標準提升研究

祝清燦，張雙情，孫宜春，汪 娥，石 亞，王 杏，段 麗，李慧馨

(國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550026)

柳枝為楊柳科植物垂柳SalixbabylonicaL.的新鮮或干燥枝條，氣微，味微苦、澀，四季采收，去葉，鮮用或切段，曬干，為《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》收錄的貴州省少數民族用藥，廣泛分布于長江流域及華南各地，貴州各地普遍栽培，具有祛風利濕、解毒消腫的功效，用于風濕痹痛、小便淋濁、黃疸、齲齒、齦腫、風疹瘙癢、疔瘡、丹毒等[1-2]。據文獻報道，柳屬植物普遍含有黃酮類化合物，以及萜類、醌類、酚苷類、苯丙素類及蒽醌類等化學成分，其中水楊苷及其多種衍生物是柳屬植物中最為廣泛存在的物質，分布在柳屬植物的樹皮、根皮、葉片中[3-4]。水楊苷是柳屬植物，具有解熱鎮痛功效的主要活性物質是其主要的功效成分，可用于退熱和治療關節炎等疾病[5-6]。原標準項下僅收載性狀、顯微鑒別、理化鑒別項目[1]，顯微鑒別時一般是對藥材進行制片顯微觀察，但在實際制片過程中切片厚薄不均勻、易碎，制片較困難。理化鑒別方法專屬性不強，影響結果的準確性。因此對原標準進行修訂，將橫切面顯微鑒別改為粉末顯微鑒別，將理化鑒別改為薄層色譜鑒別，提高方法的可操作性和專屬性，同時，增加水分、總灰分、浸出物檢查，為質量標準修訂提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

WHF-3型三用紫外分析儀(武漢藥科新技術開發有限公司生產)；CX41型顯微鏡(OLYMPUS CORPORATION)；101-2A型電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；HH-4型數顯恒溫水浴鍋[ 常州普天儀器制造有限公司(金壇市晶玻實驗儀器廠)]，ME204TE/02型電子天平[梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司]；SB25-12DTS型數控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

水楊苷對照品(購自北京百靈威科技有限公司，批號：195686，含量98%)；丙酮(批號：20161001)、正丁醇(批號：20170301)、甲醇(批號：20161001)、乙醇95%(批號：20170901)、甲酸(批號：20091009)、硫酸(批號：20160801)、三氯甲烷(批號：20170801)購自重慶川東化工(集團)有限公司；石油醚(30～60 ℃)(批號：20160801)、乙酸乙酯(批號：2016071501)購自成都科隆化學品有限公司。

1.3 材料

羧甲基纖維素鈉(廠家：天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2016041022)；薄層層析硅膠G(批號：20151008)、硅膠G薄層板(批號：20170929)、硅膠G高效板(批號：20170831)、硅膠H板(批號：20160715)、硅膠GF254板(批號：20140910)均購自青島海洋化工有限公司；硅膠G預制板(德國默克公司，批號：1.05626.0001；國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170912)；自制硅膠G薄層板(批號：20171120)。

樣品由國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司種植部提供，經貴州中醫藥大學藥學院何順志教授鑒定為楊柳科植物垂柳SalixbabylonicaL.的新鮮或干燥枝條。憑證標本存放于國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司。樣品詳細信息，見表1。

表1 樣品名稱及產地來源

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別

將采集的藥材樣品除去雜質后曬干，對藥材樣品的大小、形狀、顏色、質地、斷面等特征進行對比觀察，對具有代表性的藥材進行拍照。其基本特征為：鮮柳枝：枝條圓柱形，直徑0.1～5 cm，段長不少于10 cm，表面暗綠色或黃棕色，無毛，上有明顯的圓點狀小枝痕，幼枝微有毛；氣微，味微苦、澀。干柳枝：外表黃褐色或棕黃色，表面微有縱皺紋。見圖1。

圖1 柳枝外觀

2.2 顯微鑒別

將樣品粉碎并進行肉眼觀察和顯微觀察，其特征為：本品粉末灰褐色；晶纖維易見，方晶眾多；草酸鈣簇晶多見，直徑11～28 μm，具緣紋孔導管；木栓細胞類方形、類三角形，內含黃棕色物。柳枝粉末顯微特征，見圖2。

注：1.草酸鈣簇晶；2.晶纖維；3.具緣紋孔導管；4.木栓細胞。

2.3 薄層鑒別

2.3.1 供試品溶液制備 取本品粉末5 g，加乙醇 50 mL，加熱回流30 min，加入25 mL 氫氧化鈣乳濁液(1 g 氧化鈣加10 mL水溶解)混勻，濾過，濾液揮干，殘渣加水20 mL使溶解，加石油醚(30～60 ℃)20 mL萃取1次，棄去石油醚萃取液，母液置水浴上揮干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液[7-9]。

2.3.2 對照品溶液制備 取水楊苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3.3 薄層鑒別方法及結果 照薄層色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0502)進行試驗[10]，吸取上述對照品溶液4 μL，供試品溶液2～5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7∶3∶1∶1)為展開劑，預飽和20 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點顯色清晰。置日光下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖3。

注：1～4、6～9為供試品；5.水楊苷對照品。

2.4 水分含量測定

精密稱取10批柳枝藥材粉末(過二號篩)各約4 g，按照2020年版《中國藥典》(四部)通則“0832水分測定法”的第二法(烘干法)進行測定[10]，每批樣品平行測定兩份，取平均值。結果，12批樣品中水分的含量最低為8.8%，最高為12.3%，平均值為10.6%，以平均測定值的120%設限，結果為12.72%，故建議將水分標準定為不得過13.0%。柳枝藥材水分含量測定結果，見表2。

2.5 浸出物含量測定

精密稱取10批柳枝藥材粉末(過二號篩)各約3 g，照醇溶性浸出物測定法(《中國藥典》2020版四部通則2201)項下熱浸法測定[10]，用50%乙醇作溶劑，每批樣品平行測定兩份，取平均值。結果，12批樣品中浸出物最低值為7.9%，最高值為10.2%，平均值為9.01%，以平均值的80%設限，結果為7.2%，故建議將浸出標準定為不得少于7.0%。柳枝藥材浸出物含量測定結果，見表2。

表2 柳枝水分和浸出物測定結果 (%)

3 討論

3.1 供試品溶液制備

根據化學成分的溶解性，分別對提取溶劑(甲醇，乙醇，水)、提取方法(超聲，回流)、萃取溶劑(乙酸乙酯，石油醚)、提取溶劑用量(30 mL，40 mL，50 mL)、提取時間(30 min，60 min，90 min)、萃取劑用量(10 mL，20 mL，30 mL)等條件進行考察，結果表明，以本研究所用制備方法制備的供試品溶液鑒別斑點最清晰。

3.2 色譜條件考察

根據展開樣品主要化學成分的極性，對展開系統，如乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7∶3∶1∶1)、氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶3∶0.1)、 氯仿-甲醇(7∶3)、氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶2∶2∶0.2)、乙酸乙酯-甲醇-水(9∶2∶0.2)、乙酸乙酯-甲醇-水(11∶2∶1)、硅膠板種類(硅膠G板、硅膠H板，硅膠GF254板，硅膠G高效板)、點樣量(2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL)、條帶點樣寬度(5 mm，6 mm，7 mm，8 mm)、薄層板預平衡時間(10 min，20 min，30 min)、展開溫度(5 ℃，20 ℃，35 ℃)等進行了考察。結果表明，采用本研究所用色譜條件時，展開效果較好，斑點清晰，偽品無相應斑點。見圖4。

注：1、4、6為水楊苷對照品；2.鮮柳枝供試品；3.干柳枝供試品；5.偽品。

3.3 浸出物測定方法考察

在進行浸出物測定時，對浸出方法(冷浸法，熱浸法)、浸出溶劑種類(甲醇，乙醇，水)、浸出溶劑(乙醇)濃度(25%，50%，75%，95%)進行考察，結果，使用本研究所用浸出方法和溶劑測定時，浸出物含量最高。

4 結語

綜上，柳枝的顯微鑒別特征易見，可操作性強；薄層色譜鑒別方法專屬性強，薄層色譜斑點清晰，分離度較好，偽品為陰性；增加水分、灰分檢查后，質量標準更完善。本研究可為提高柳枝藥材的質量控制標準提供科學依據。