基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探索龜甲治療骨關(guān)節(jié)炎的潛在機制

朱香梅，李 晴，石雨荷，朱 玨，童巧珍*，劉湘丹，王 智

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點研究室，湖南 長沙 410208；3.湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)一種退行性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退化、軟骨下骨硬化、炎癥和滑膜增生等為主要病理特點[1]。主要臨床癥狀包括慢性疼痛、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定、僵硬和放射性關(guān)節(jié)間隙狹窄。衰老、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、肥胖和遺傳傾向是骨關(guān)節(jié)炎形成的重要原因[2]。全世界大約有3億人患有骨關(guān)節(jié)炎，其中60歲以上人群中，女性發(fā)病率占18%，男性占10%[3]。隨著人口老齡化，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率呈快速上升趨勢，是老年人致殘的主要原因。目前，西醫(yī)基礎(chǔ)治療主要以緩解癥狀及矯正畸形為主，藥物治療以鎮(zhèn)痛藥和關(guān)節(jié)局部藥物注射為主，手術(shù)治療多以截骨術(shù)和關(guān)節(jié)置換術(shù)為主，但治療效果不佳[4]。中醫(yī)學(xué)認為OA屬“骨痹”范疇，肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)為本，風(fēng)寒濕痰瘀為標，筋骨經(jīng)脈不通不榮為其主要病機，病理性質(zhì)多屬本虛標實[5]。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥多成分、多靶點的特點在防治骨關(guān)節(jié)炎過程中占有重要地位。

龜甲為龜科動物烏龜Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲，性甘，味咸，具有滋陰潛陽、益腎強骨的功效[6]。龜甲化學(xué)成分包括膠原蛋白、氨基酸、脂肪酸、微量元素等，常炮制成龜甲膠來提高免疫功能、延緩衰老，是中高端滋補藥材市場的主要產(chǎn)品[7]。研究表明，龜甲可促進軟骨細胞Ⅱ型膠原的合成，促進軟骨細胞增殖，發(fā)揮該作用的物質(zhì)以龜甲膠為主，進一步研究發(fā)現(xiàn)龜甲膠通過調(diào)控p38 MAPK、JNK、ERK1/2等基因表達水平，從而減緩骨關(guān)節(jié)炎的進展[8]。龜甲作為膠類藥食同源藥材之一，其治療骨關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和機理研究進展緩慢。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測龜甲活性成分治療骨關(guān)節(jié)炎的作用靶點與通路，并采用分子對接技術(shù)對其核心靶點及其相關(guān)活性成分進行對接，初步探討龜甲在關(guān)節(jié)炎治療中的作用機制，以期為龜甲治療骨關(guān)節(jié)炎的藥理研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)庫

本研究涉及的數(shù)據(jù)庫如表1所示。

表1 本研究涉及的數(shù)據(jù)庫

2 方法

2.1 龜甲活性成分篩選

以“GUI BAN、GUI JIA、ZHI GUI BAN或GUI BAN JIAO”為檢索詞，利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫收集龜甲化學(xué)成分，并通過查閱相關(guān)文獻查找數(shù)據(jù)庫未收載的成分，合并去除重復(fù)部分，最終確定其活性成分。

2.2 龜甲作用靶點與骨關(guān)節(jié)炎靶點的篩選

利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，收集龜甲化合物靶點，以Probability>0.01進行靶點篩選，最終獲得龜甲的作用靶點。在TTD數(shù)據(jù)庫、PharmGkb數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫中以“Osteoporosis”為檢索詞進行搜索，得到骨關(guān)節(jié)炎的靶點。

2.3 龜甲治療骨關(guān)節(jié)炎潛在作用靶點的篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將龜甲活性成分與骨關(guān)節(jié)炎的靶點輸入Venny 2.1在線平臺，繪制出韋恩圖，同時獲取兩者的交集靶點，這些交集的靶點即龜甲治療骨關(guān)節(jié)炎潛在的作用靶點。在Cytoscape 3.8.2軟件中導(dǎo)入成分與疾病靶點，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 潛在作用靶點生物過程及通路的富集分析

將在“2.3”項獲得的潛在作用靶點通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成Uniprot ID，導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因本體論(GO)生物過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路的富集分析。

2.5 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

在String數(shù)據(jù)庫“Multiple Proteins”中導(dǎo)入潛在的作用靶點，限定Organism為“Homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用評分為中等置信度0.4，獲得蛋白互作圖，下載TSV格式文件保存。在Cytoscape 3.8.2軟件中導(dǎo)入TSV文件進行可視化，使用CytoNCA插件篩選龜甲治療骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點。

2.6 分子對接評估結(jié)合潛力

利用iGEMDOCKV2.1軟件對龜甲治療骨關(guān)節(jié)炎的核心靶點及相對應(yīng)的活性成分進行對接。首先，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫選定“Homo sapiens”“PDB ID”“Ligand”“Value”進行搜索，以Resolution<2.5、結(jié)構(gòu)復(fù)合體中有小分子配體信息、結(jié)晶pH值接近人正常生理范圍等進行篩選，下載核心靶點PDB格式。從PubChem中下載活性成分的2D結(jié)構(gòu)，通過OpenBabel軟件轉(zhuǎn)化成mol2格式保存。將核心靶點PDB及性成分配體mol2格式分別導(dǎo)入iGEMDOCK軟件中的Prepare Binding Site和Prepare Compounds，選擇標準對接模式：Population size=200，Generation=70，Number of solution=2,進行分子對接[9]。結(jié)果以能量高低判斷配體與受體的結(jié)合程度，化合物分子與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生作用的可能性越大[10]。

3 結(jié)果

3.1 龜甲活性成分

從BATMAN-TCM和TCMID數(shù)據(jù)庫中分別檢索到龜甲成分數(shù)量為10個和40個，查閱龜甲活性成分研究文獻，補充18個，去除未找到靶點和重復(fù)的成分后共27個。見表2。

表2 龜甲活性成分信息

3.2 龜甲治療骨關(guān)節(jié)炎潛在的治療靶點

在SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中檢索27個活性成分作用靶點，去除重復(fù)后共獲得314個靶點。經(jīng)TTD、PharmGkb、OMIM 和Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索骨關(guān)節(jié)炎靶點，分別檢索到18、9、9和155個疾病相關(guān)靶點，篩選去重后共獲得180個靶點。通過Venny2.1在線平臺對314個龜甲活性成分靶點和180個骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點進行交集映射，得到41個共同靶點(圖1)，即龜甲抗骨關(guān)節(jié)炎的潛在作用靶點。在Cytoscape 3.8.2中導(dǎo)入篩選后的藥物靶點和疾病靶點，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)，該網(wǎng)絡(luò)有482個節(jié)點，1 270條邊，結(jié)果顯示，龜甲抗骨關(guān)節(jié)炎潛在的作用靶點包括：脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)、過氧化物酶體增殖物激活受體δ(PPARD)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、組胺H2受體(HRH2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲氨酸蛋白酶抑制劑A6(SERPINA6)、醛酮還原酶家族1成員C1(AKR1C1)、胞質(zhì)磷脂酶A2(PLA2G4A)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARA)、多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶(ALOX5)、醛酮還原酶家族1成員B10(AKR1B10)、甘氨酸受體亞基α-1(GLRA1)、視黃酸受體α(RXRA)、細胞色素P450(CYP2C19)、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2B7(UGT2B7)、磷脂酶A2(PLA2G1B)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(ABCC1)、磷脂酶A2磷脂酶A2膜相關(guān)(PLA2G2A)、皮質(zhì)類固醇11β脫氫酶同工酶1(HSD11B1)、γ-氨基丁酸受體亞單位α-2(GABRA2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、膽堿酯酶(BCHE)、溶質(zhì)載體家族22成員6(SLC22A6)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP2)、雄激素受體(AR)、醛酮還原酶家族1成員B1(AKR1B1)、碳酸酐酶2(CA2)、乙酰膽堿酯酶(ACHE)、過氧化物酶體激活受體-γ增殖體(PPARG)、醛酮還原酶家族1成員C2(AKR1C2)、γ-氨基丁酸受體亞基α-1(GABRA1)、前列腺素D2受體2(PTGDR2)、前列腺素E2受體EP1亞型(PTGER1)、ATP依賴性易位酶(ABCB1)、瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員1(TRPV1)、膽汁酸受體(NR1H4)、糖皮質(zhì)激素受體(NR3C1)。

圖1 龜甲-骨關(guān)節(jié)炎交集靶點韋恩圖

3.3 GO生物過程與KEGG通路富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對龜甲治療骨關(guān)節(jié)炎的41個潛在靶點進行GO基因功能注釋分析，以P<0.05為篩選條件，最后共富集到123個具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物注釋過程，其中生物過程72個、細胞組成17個、分子功能34個，根據(jù)P值由小到大的順序，以氣泡圖形式呈現(xiàn)排名前15位的功能注釋過程，見圖3(A)。結(jié)果顯示，在排名前15的功能注釋過程中，主要的生物過程為：RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄起始、氧化還原過程、脂質(zhì)代謝過程、細胞內(nèi)受體信號通路、花生四烯酸代謝過程、類固醇代謝過程等，主要細胞組成：細胞器膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、氯離子通道復(fù)合體、細胞外間隙等，主要分子功能包括類固醇激素受體、醛酮還原酶(NADP)活性、藥物結(jié)合、酶結(jié)合等。生物過程中的氧化還原過程、細胞組成中的細胞器膜、分子功能中的鋅離子結(jié)合富集的蛋白最多，結(jié)果見圖3(B)。

圖3 龜甲治療OA的GO富集分析

通過對41個潛在的作用靶點進行KEGG分析，共富集到33條通路，其中顯著富集(P<0.05)的25條。按照P值升序的方式，以條形圖的形式展示前20條通路，如圖4所示。結(jié)果顯示，41個潛在作用靶點涉及花生四烯酸代謝、5-羥色胺能突觸、PPAR、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、類固醇激素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化及癌癥途徑信號通路。

圖4 KEGG富集分析

3.4 潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將41個潛在作用靶點輸入String網(wǎng)站，獲得39個相互作用的靶點，導(dǎo)出相互作用數(shù)據(jù)后利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，同時用CytoNCA插件對靶基因進行計算每個靶點的Degree值。如圖5所示，39個節(jié)點共產(chǎn)生122條邊，其中圓形越大代表Degree值越大，線條越粗相互作用越強。該網(wǎng)絡(luò)Degree平均值為6.26，其中超過Degree均值的靶點16個，如圖6所示分別為：PTGS2、TNF、MAPK3、PPARG、ALOX5、PTGS1、NR3C1、CYP2C19、PLA2G1B、PLA2G-4A、RXRA、ABCB1、PLA2G2A、PPARA、AR、NOS2。其中PTGS2、TNF、MAPK3的Degree值超過均值兩倍分別為21、18、16，可能是龜甲治療骨關(guān)節(jié)炎過程中起效的核心靶點。

圖5 龜甲治療OA潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因

3.5 i GEMDOCK分子對接結(jié)果

篩選PPI網(wǎng)絡(luò)分析中Degree值大于中位數(shù)的核心靶點為：PTGS2(PDB ID：5IKR)、TNF(PDB ID：2QD9)、MAPK3(PDB ID：2ZOQ)、PPARG(PDB ID：1ZGY)、NR3C1(PDB ID：4MDD)、RXRA(PDB ID：3OAP)，將其與相對應(yīng)的活性成分進行對接，同時選用目前臨床應(yīng)用較多的治療OA藥物雙氯芬酸鈉(PubChem ID：5018304)、西樂葆(PubChem ID：2662)作對照，研究發(fā)現(xiàn)配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生作用的可能性越大，結(jié)果見表3。與靶點PTGS2、TNF和NR3C1結(jié)合最好的是十四酸甾醇酯，與靶點MAPK3和PPARG較好結(jié)合的是(E)-11-二十碳烯酸，與靶點RXRA較好結(jié)合的是十五烷酸，且可以看出龜甲活性成分與靶點結(jié)合活性普遍高于陽性對照藥。運用i GEMDOCK軟件進行分析，并將龜甲與關(guān)鍵靶點對接結(jié)果可視化，結(jié)果見圖7。綜上可知，龜甲中的化學(xué)成分與核心靶蛋白均有較好的結(jié)合活性。

注：圖片右下角字母代表蛋白配體(PTGS2：ID8、TNF：LGF、MAPK3：5ID、PPARG：BRL、NR3C1：29M)。

4 討論

龜甲作為藥用始載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》，謂“龜甲，味咸平，主漏下赤白、破癥瘕核瘧、濕痹、四肢重弱……”[11]龜甲膠起源于龜甲，對腰膝酸軟、久咳不愈、骨蒸盜汗等有很好的輔助治療作用，在歷版《中華人民共和國藥典》中龜甲所制得的各類龜甲膠均有收載。龜甲作為傳統(tǒng)的補腎健骨中藥，在臨床上用于骨病的治療己有很長的歷史。因此，近年來龜甲治療OA的作用引起了廣泛關(guān)注，臨床研究表明，龜甲散劑、龜甲針對骨性關(guān)節(jié)炎等骨科疾病，效果顯著[12]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明龜甲膠能夠修復(fù)受損軟骨從而延緩骨關(guān)節(jié)炎的病理進程[13]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對龜甲治療OA的作用進行挖掘，結(jié)果顯示，龜甲包含27個活性成分，對應(yīng)314個靶點，與OA相關(guān)的180個靶點交集映射后獲得41個潛在作用靶點。通過構(gòu)建41個靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選到了龜甲治療OA的關(guān)鍵靶點包括PTGS2、TNF、MAPK3、PPARG等。MAPK3屬于絲裂原激活蛋白激酶家族成員，與抗炎、抗軟骨細胞凋亡有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)壯骨健脾湯可以通過抑制MAPK信號通路來預(yù)防軟骨細胞凋亡，從而治療骨關(guān)節(jié)炎[14]。臨床研究表明TNF-α水平在OA患者的滑液、滑膜、軟骨下骨和軟骨中升高，證實了其在OA發(fā)病機制中的重要作用[15]。TNF在滑膜組織中誘導(dǎo)一氧化氮(NO)，同時阻斷其受體，抑制人軟骨中NO的生成。且TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生其他細胞因子，抑制蛋白多糖和II型膠原的合成，因此TNF-α在OA軟骨基質(zhì)降解和骨吸收中起著關(guān)鍵作用[16]。PTGS2編碼環(huán)氧合酶-2，具有高度多態(tài)性，在人類OA軟骨細胞中高表達[17]，對緩解軟骨細胞損傷起著重要作用。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)在關(guān)節(jié)軟骨中的累積被認為是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的主要危險因素，AGEs通過與PPARG相互作用激活A(yù)KT/MTOR信號通路，誘導(dǎo)軟骨細胞自噬維持細胞活力[18]。除去沒有配體結(jié)構(gòu)的靶點蛋白，共6個核心靶點進行分子驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)核心靶點與對應(yīng)成分對接的能量值大多比陽性對照組低，表明龜甲成分和核心靶點之間的結(jié)合活性較高，存在較好的治療潛力。其中十四酸甾醇酯能量值最低，(E)-11-二十碳烯酸、亞油酸及十五烷酸等能量較低，結(jié)合性較好，且整體比陽性藥結(jié)果好，可能是治療OA的潛在成分。

41個潛在作用靶點的GO功能富集結(jié)果顯示，與龜甲治療OA密切相關(guān)的生物過程包括RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄起始、氧化還原過程、脂質(zhì)代謝過程、細胞內(nèi)受體信號通路、花生四烯酸代謝過程等。KEGG通路富集結(jié)果顯示，龜甲的作用途徑包括花生四烯酸代謝、5-羥色胺能突觸、PPAR、類固醇激素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化及癌癥途徑信號通路等。研究表明，5-脂氧合酶(5-LOX)介導(dǎo)的花生四烯酸代謝升高可能有助于觀察到非甾體抗炎藥在OA中的副作用，證實了其在OA的發(fā)生發(fā)展及治療中具有潛在作用[19]。PPAR通過調(diào)節(jié)各種信號通路來調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)，減少人體OA軟骨的炎癥反應(yīng)[20]。糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)合成和釋放的類固醇激素，在骨關(guān)節(jié)炎中，合成糖皮質(zhì)激素可以很好地減輕炎癥和疼痛，主要通過減少膠原Ⅱ的降解，保護分解代謝激活軟骨細胞[21]。綜上所述，龜甲治療OA的作用可能與調(diào)控炎癥、軟骨代謝、細胞凋亡等有關(guān)。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究了龜甲與OA的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，運用分子對接證明了龜甲治療OA的合理性，最終預(yù)測了龜甲治療OA的潛在作用靶點及其作用途徑，并篩選了核心靶點，以探討其可能的分子機制。但是該研究主要依據(jù)數(shù)據(jù)庫信息，考慮數(shù)據(jù)與方法試驗存在一定的局限性，龜甲具體作用機制的確認仍需通過進一步實驗來對預(yù)測結(jié)果進行驗證。