基于數據挖掘和網絡藥理學的中成藥治療胸痹配伍規律及潛在機制研究

姚昆鵬，劉起立，張道平，石 靜，蔡子杰，蔡虎志，陳新宇，*

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

胸痹是指以胸部悶痛，甚則胸痛徹背，不得平臥為主要表現的一類病證。中醫學對胸痹的記載始見于《靈樞·五邪》，曰：“邪在心，則病心痛。”[1]歷代醫家對胸痹分別加以論述，并提出“猝心痛”“厥心痛”“真心痛”等病名，直至仲景《金匱要略》方才提出“胸痹”之名稱，并將其病機歸納為“陽微陰弦”[2]。由于輕者表現為胸部悶痛，呼吸不暢，重則胸痛劇烈，冷汗淋漓，現代醫學多將其歸屬于冠心病范疇[3-4]。截至2020年，流行病學統計顯示，中國心血管疾病患病人數3.3億，其中冠心病患者高達1 100萬人[5]。冠心病全稱動脈粥樣硬化性心臟病，現代醫學將其分為慢性冠脈病與急性冠狀動脈綜合征。冠心病具有高發生率、高病死率的特點，且不穩定型心絞痛及急性心肌梗死的患病人數逐年上升[6]。由于心肌細胞損傷的不可逆性，冠心病患者的預后較差，生活質量下降。若出現急性心肌梗死，甚則危及患者生命。

目前現代醫學多予以藥物、冠脈支架植入術、冠狀動脈搭橋術等方法進行干預，但大量研究表明，仍有患者不能耐受上述治療，或存在復發等不良后果[7]。中醫藥具有低毒副作用、效佳價廉的特點。隨著近年來對傳統醫藥研究的深入，多種中成藥制劑也投入到冠心病的臨床治療中。2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)是國家藥品監督管理局國家藥典委員會頒布的法典，旨在提升藥物治療、保障用藥安全。通過文獻檢索發現，已有對藥典所收錄的中藥飲片的歸類及組方配伍的相關研究，或對其收錄的成方制劑或單味制劑進行數據挖掘[8-11]，鮮少見到針對胸痹這一中醫病證名的中成藥數據挖掘，并探析其潛在作用機制。本研究以2020年版《中國藥典》(一部)中治療胸痹的中成藥的成方名稱、中藥成分、性味歸經、功能與主治為研究對象，采用數據挖掘及網絡藥理學方法，探索《中國藥典》收錄的治療胸痹的中成藥制劑的用藥特點，并分析其潛在分子機制，為中醫藥治療胸痹及新藥研發提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數據來源

根據2020年版《中國藥典》(一部)中“成方制劑和單位制劑”部分的藥物索引，依次在逐個藥物的功能與主治中選取關鍵詞為：“胸痹”“猝心痛”“厥心痛”“胸悶”“胸痛”“胸痹心痛”“冠狀動脈粥樣硬化性心臟病”“冠心病”“心絞痛”“心肌梗死”等用于治療胸痹的中成藥。對于劑型不同但藥方及藥量一致的方劑，如：穩心片、穩心顆粒、穩心膠囊計為1個中成藥。

1.2 數據篩選與處理

采取雙人輸入，第三人校對審核的方式。將符合“1.1”項下條件的中成藥方中的方劑名稱、功能與主治及中藥成分錄入Microsoft Excel 2016，建立胸痹中成藥數據庫；參考2020年版《中國藥典》(一部)對納入的中藥名稱進行統一規范，如“九節菖蒲”“菖蒲”規范為“石菖蒲”，“炒乳香”規范為“乳香”，“炒沒藥”規范為“沒藥”，并依據2020年版《中國藥典》(一部)及“十二五”規劃的《中藥學》教材進行性味歸經、藥物分類等。

1.3 數據處理與分析

1.3.1 用藥規律的分析與預測 對“1.2”中錄入的數據進行統計，運用Microsoft Excel 2016、IBM SPSS Modeler 15.0及IBM SPSS Statistics 25進行如下處理。

(1)頻數統計。采用Excel表格對納入數據進行頻數分析，統計各中成藥的頻數、性味歸經及功效分類，并提取高頻藥物，初步歸納出中成藥治療胸痹的用藥規律及高頻藥物群。

(2)藥物關聯度分析。運用IBM SPSS Modeler 15.0中Apriori算法對使用頻次排名前20的中藥進行關聯規則分析，設置條件：最小支持度為10%，最小置信度為65%，最大前項數為5。核心藥對18個。全部藥物組合的提升度都大于1，表明上述藥物組合在統計學上均有意義，按照置信度從大到小排序。

(3)聚類分析。將數據導入IBM SPSS Statistics 25軟件中，對高頻藥物進行系統聚類分析，選擇聚類方法為組間聯合、皮爾遜相關性，最小聚類數5，最大聚類數10，得到中藥聚類組合及聚類分析譜系圖。

1.3.2 網絡藥理學對藥物的深度分析 將“1.3.1”中所得的核心藥物，在中醫藥系統藥理學平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)先后進行有效成分篩選，同時在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數據庫，使用“Coronary heart disease”作為檢索詞獲取冠心病的相關靶標，再繪制韋恩圖構建中藥-疾病交集靶點，在Cytoscape 3.7.1中構建藥物-疾病-靶基因網絡圖，并將基因提交至STRING網站繪制蛋白質相互作用關系圖，再利用R3.6.1軟件進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，預測2020年版《中國藥典》(一部)中治療胸痹的最高頻藥物的可能作用機制。

2 結果

2.1 藥頻統計

經過數據搜集、篩選與整理，在2020年版《中國藥典》(一部)中共選取到135個中成藥制劑，其中65個為劑型不同但藥方一致，予以合并，共計81個有效中成藥處方。對符合納入標準的81個有效中成藥處方的135味中藥進行頻數統計、性味歸經及藥物功效分類統計，結果如下。

2.1.1 納入藥物使用頻次分析 經過篩選，最終納入中成藥制劑81個，涉及135味中藥，藥物總頻次511次。使用頻次大于10次的中藥命名為高頻藥物，共計11味，由多到少排列依次為丹參、川芎、三七、冰片、黃芪、人參、赤芍、紅花、葛根、麥冬、山楂，見表1。

表1 《中國藥典》治療胸痹中成藥的高頻藥物統計

2.2.2 納入藥物性味歸經頻次分析 將納入藥物的四氣、五味、歸經數據進行頻次分析。藥物在四氣中所占比重從大到小依次為溫(47次)>寒(42次)>平(36次)>涼(6次)>熱(4次)，見圖1A。藥物在五味中所占比重從大到小分別為苦(65次)>辛(55次)>甘(48次)>酸(14次)>咸(11次)>澀(7次)>淡(3次)，見圖1B。藥物歸經按頻次從多至少依次為肝經(73次)>心經(61次)>脾經(49次)>肺經(45次)>腎經(44次)>胃經(33次)>大腸經(15次)>膽經(10次)>膀胱經(8次)>心包經(4次)>三焦經(2次)>小腸經(1次)，見圖1C。

圖1 《中國藥典》治療胸痹中成藥藥物的四氣、五味、歸經統計

2.2.3 納入藥物功效分類 符合納入標準的藥物，按照作用分類，可以分為17類，其中補虛藥頻次居首位，藥味達30味，頻次達130次，頻率為25.44%，余下依次為活血化瘀藥、開竅藥、清熱藥、理氣藥、解表藥、止血藥、平肝熄風藥、消食藥、收澀藥、安神藥、化痰止咳平喘藥、利水滲濕藥、溫里藥、攻毒殺蟲止癢藥、祛風濕藥、涌吐藥，具體見表2。

2.2 關聯分析與聚類分析

2.2.1 《中國藥典》中治療胸痹常用藥的關聯分析 運用IBM SPSS Modeler 15.0 對所有藥物用Apriori算法進行關聯規則分析，設置最小支持度為10%，最小置信度為65%，最大前向項數為5，置信度由高到低排序，共核心藥對18個,見表3。

表2 《中國藥典》中成藥治療胸痹藥物的分類統計分析

表3 《中國藥典》中成藥治療胸痹藥物組合的關聯規則分析

2.2.2 《中國藥典》中治療胸痹常用藥的聚類分析 將頻數>10的藥物列為高頻藥物，共計11種，導入IBM SPSS Statistics 25中，對高頻進行聚類分析，選擇聚類方法為組間聯合、皮爾遜相關性，最小聚類數5，最大聚類數10，結合中醫學相關理論，得到4個中藥聚類組合，見表4、圖2。

表4 《中國藥典》中成藥治療胸痹藥物的聚類組合

圖2 《中國藥典》中成藥治療胸痹藥物的聚類分析譜系圖

2.3 網絡藥理學分析——核心藥物治療胸痹的潛在作用機制分析

2.3.1 核心藥物的靶標預測結果 通過數據挖掘分析，丹參、川芎、三七的使用頻率最高，且在關聯規則分析中丹參、川芎、三七也均出現在藥味組合中，因此將上述三味藥物定義為核心藥物。在中藥系統藥理學數據庫分析平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索核心藥物的活性成分和作用靶點，并根據口服生物利用度≥30%以及類藥性≥0.18，除去重復項和未存在的映射關系，篩選出77個有效成分、242個作用靶點。通過GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數據庫，使用“Coronary heart disease”作為檢索詞獲取冠心病的相關靶標，得到作用靶點，見表5。除去重復靶點，最終獲得疾病靶點數7 337個。

表5 冠心病相關靶標

2.3.2 核心藥物治療冠心病的蛋白、基因分析 通過Venn圖得到核心藥物的活性成分與疾病的交集靶點180個，利用STRING(https：//string-db.org/)數據庫獲取蛋白互作關系，得到PPI網絡，最后利用Cytoscape軟件構建疾病-藥物-活性成分-靶點網絡，外圈代表藥物的成分，內圈代表作用靶點，靶點越大表明藥物對應靶點越多，見圖3。PPI網絡圖中靶蛋白之間作用關系的強弱與靶蛋白對應的顏色深淺以及蛋白之間連線的粗細、顏色深淺呈正相關。

圖3 核心藥物-有效成分-靶點網絡

2.3.3 核心藥物治療冠心病的GO及KEGG富集分析 通過數據庫Bioconductor(http：//bioconductor.org/)對核心藥物治療胸痹作用的靶標進行基因Symbol的ID轉換，運用R 語言的 ClusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2包進行GO和 KEGG富集分析，GO分析共獲得涉及BP(生物過程)2 509個，CC(細胞組分)112個，MF(分子功能)238個，取前10繪制GO富集分析氣泡圖，見圖4A。其中點越大則富集基因越多，P值越小顏色越深，代表與核心藥物組合治療冠心病關系越密切。主要涉及藥物反應、氧化應激反應、細胞化學應激反應、金屬離子反應等生物過程。KEGG通路富集獲得172條信號通路(P<0.05)，取前30條繪制氣泡圖，見圖4B，主要涉及PI3K-Akt、IL-I7、HIF-1等通路。

圖4 核心藥物潛在靶點的GO、KEGG分析

3 討論

張仲景在東漢時期已提出胸痹之病機為“陽微陰弦”，即胸中陽氣虛衰，下焦陰寒內盛。根據頻數分析，在2020年版《中國藥典》(一部)中成藥制劑中，用于治療胸痹的藥物多歸肝經、心經，且其性味多呈溫性、寒性、苦味、辛味，核心藥物中以補虛藥、活血化瘀藥居多。自古以來醫家多認為胸痹雖病位在心，而與肝臟關系密切，肝主條達，氣機不睦則心血不行，或生痰熱，或滋寒濕，故用藥不離寒溫兩端，或以溫心肺陽氣，或以清火化痰?？辔督敌幕穑廖镀脐幗Y。從病機而言，胸痹之罹患，初以痰濁、水飲、瘀血等為因，為邪實，故以攻法；遷延日久，則見正氣虧虛，氣血陰陽俱損，宜施補法。由此觀之，中成藥治療胸痹多以扶正補虛為基本治法，兼顧活血、理氣、清熱，在此基礎上針對瘀血、痰濁等病理產物加以干預?！妒備洝吩凇爸涡乇灾T方”“治猝心痛方”中運用通氣湯、桂姜丸、木香丸等來治療胸痹，觀其方具有芳香理氣、活血通竅之功[12]。通過對數據進行關聯分析，發現丹參、川芎、三七、紅花、赤芍、黃芪等為核心配伍，由此可知2020年版《中國藥典》(一部)治療胸痹的中成藥制劑多以益氣活血清熱為立方之法。聚類分析得到4個藥物組合，即川芎-紅花-赤芍、丹參-黃芪-葛根-山楂、人參-麥冬、三七-冰片。從結果來看，活血、益氣、清熱、滋陰為胸痹之經典治法，在此基礎上配合調脂、開竅、行氣。胸痹患者多為青老年人，嗜食肥甘厚味，疏于養護攝生，厚味肥甘易生痰濁，阻滯脾胃氣機，形成惡性循環，痰濁、瘀血為陰邪，性守地而不行，壅塞之處，經絡不通，四肢九竅，無不入者[13]。人多清竅，其氣虛、血虛、陰虛、陽虛之態，常易釀生瘀血、痰濁，人之欲念繁多，最易肝氣不得疏泄，氣機失于條達，諸多病理產物不運，清竅不利，故常須佐以調脂、開竅、行氣之品[14]。相關研究表明，現代醫家治療胸痹心痛多運用活血養血、補益心氣、化濁祛痰之品[15]。通過藥物對病機進行推演，胸痹的病機以正氣虛衰為主，兼以瘀、熱、痰、毒。現代研究表明，冠心病的發病機制與脂質沉積、血栓形成、炎癥-纖維增生性反應以及內皮細胞功能障礙有關[16-19]。本文研究的核心藥物丹參、川芎、三七均為活血止血之品，而又各有側重，丹參、川芎主活血化瘀，三七化瘀止血，兼有補虛之功，恰與脂質沉積、血栓形成的機制相合。

通過數據挖掘分析，發現中成藥治療胸痹以扶正補虛為主，兼以活血、理氣、清熱，然而對其作用靶點與機制不甚清楚。進一步進行網絡藥理學分析，通過以“Coronary heart disease”作為關鍵詞，共篩選出77個化學成分、242個作用靶點，得到核心藥物的活性成分與疾病的交集靶點180個，核心藥物組合的關鍵靶點主要是PTGS2、ADRB2、NCOA1、RXRA、CHRM3、SCN5A，主要涉及PI3K-Akt、TNF、IL-17、HIF-1等信號通路。在PI3K-Akt通路中，又與ERK、PKCs、eNOS、Bcl-2、Caspase9等靶點具有較大聯系。研究表明，丹參含有多種生物活性成分，其中丹酚酸B、丹參酮IIA作為兩個主要成分，在心肌梗塞小鼠模型中，通過調節一氧化氮(NO)及其合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthases，eNOS)的途徑發揮舒血管作用，并通過刺激MAPK/Akt磷酸化，抑制心臟肥大，減少梗死面積[20-21]。ERK、PKCs、Caspase9是PI3K通路的經典下游分子[22]。在缺氧條件下，細胞對外界做出創傷應激反應，在一定程度上加劇缺氧及器官損害，川芎嗪作為川芎的根莖提取物具有抑制該病理過程的作用[23]。進一步研究發現，川芎嗪通過激活HIF-1α/JNK/P38通路，顯著提高了缺氧相關蛋白HIF-1α、BNIP3和IGFBP3的水平，上調了Caspase9、Caspase3的表達，從而達到保護缺氧心肌細胞的作用[24]。諸多學者對丹參和三七的中藥單體及復方做出了探索，研究表明，三七總皂苷通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPK)細胞內信號通路，調控GATA轉錄因子中多種蛋白激酶的表達，發揮促進細胞增殖與分化作用[25]。一項對三七與丹參的合方結果表明，其作用機制可能與調節體內脂代謝相關[26]。綜上所述，中醫藥治療胸痹，具有多方位、多靶點的特點，核心藥物丹參、川芎、三七或可成為中醫藥治療胸痹的下一階段研究方向。

本研究初步探索了2020年版《中國藥典》(一部)中成藥制劑治療胸痹的組方用藥規律及相關疾病的作用靶點及通路，為新藥開發及臨床組方用藥提供了一定的借鑒意義。在探究過程中，課題組總結出本研究存在以下不足：其一，由于疾病靶點數據庫的收錄緣故，無法以中醫病證名“胸痹”作為關鍵詞進行檢索，僅能以西醫病名“Coronary heart disease”獲取疾病靶點。胸痹與冠心病之證候相似，二者卻并不完全等同，胸痹以癥狀作為病名，范圍更為寬泛，其疾病靶點理論上多于冠心病。限于目前對傳統醫學的相關研究不足，待后續數據庫完善，可進行補充。其二，由于篇幅的有限性，在關聯與聚類分析以及網絡藥理學研究部分，著重對高頻藥物以及核心藥物進行了分析，由于中藥具有多靶點、全方位作用的特點，后續亦可以對本文中非高頻藥物、非核心藥物進行相關研究，以期更好地指導胸痹的臨床治療。