基于生物信息學數據庫探究甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤疾病間的病變關聯

方 瓊，錢衛斌，郭叢叢*

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014)

甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤是多發于育齡期婦女的3種獨立疾病，其與女性月經初潮、妊娠和絕經時間息息相關。近年來，這3種疾病在女性患者中發病率逐年增高，且常常合并存在。研究發現，子宮肌瘤患者甲狀腺結節的發生率是正常女性的1.93倍，乳腺纖維瘤的發生率是正常女性的2.17倍[1]。吳俊芳[2]通過總結83例女性患者的 B 超檢查結果發現，乳腺結節患者甲狀腺結節的發病率為正常對照組的2.69倍。王營營等[3]研究發現，超聲檢測出甲狀腺損害(甲狀腺彌漫性損害和甲狀腺結節)患者同時伴有乳腺增生或子宮肌瘤陽性率為94.3%。從現代醫學角度而言，乳腺、子宮與甲狀腺同屬激素反應性器官，受下丘腦-垂體-腺體軸調控，但3種疾病間的病變分子機制尚不完全清楚。從中醫理論角度講，汪濤等[4]認為這3種疾病均屬于足厥陰肝經病證，治療當從“肝”論治。隨著生物信息學及網絡數據庫的不斷發展，基于特定生物醫學數據庫，挖掘疾病間的關聯網絡可客觀描述疾病間的內在關系。此外，基于網絡藥理學方法可將中藥成分、靶點與疾病間相互作用聯系起來，從而揭示中藥對機體的復雜作用機制[5-6]。筆者基于醫學數據庫，嘗試以“共有靶基因”為聯系點，分析上述3種疾病的內在分子關聯。借助網絡藥理學方法，圍繞靶點-通路、靶點-中醫癥狀、靶點-中藥治療等方面，闡釋中醫治療甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤的潛在分子靶點及成分物質基礎，為今后中醫藥研究提供方向。

1 方法

1.1 甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤疾病靶點獲取

分別在DisGeNET(http：//www.disgenet.org)、 Gencards(http：//www.genecards.org/)、CooLGeN數據庫(http：//ci.smu.edu.cn/CooLGeN/)輸入“Thyroid nodule”“Breast nodule”或“mammary gland nodule”“uterine leiomyomas” 或“uterine fibroid” “Hysteromyoma”等關鍵詞獲得甲狀腺結節、乳腺結節及子宮肌瘤的相關作用靶點。

1.2 共同靶點網絡分析

Metascape(http：//metascape.org/)為一個整合了GO、KEGG、Drugbank等多個數據庫，可用于生物過程注釋和通路分析的綜合數據庫，能較大程度保證數據的時效性[7]。采用 Metascape對甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤的共有靶點進行分析，設置物種為人。保留KEGG 通路分析的結果，根據log(P-value)的大小對結果進行排序，保留排名靠前的結果。

將共同靶點導入String數據庫(https：//stringdb.org/)中獲取蛋白-蛋白相互作用關系，并用Cytoscape 3.7.2軟件繪制蛋白相互作用網絡。為進一步確定該網絡的關鍵基因，利用network analyzer計算出該網絡平均最短路徑長度(Average shortest path length)、介數(Betweenness centrality)、自由度(Degree)等參數，以估計各共有靶點在該網絡中的重要性。利用Degree值及R加權平均最短路徑長度和介數篩選出3種疾病的20個關鍵基因。R值具體計算公式如下[8]：

R=[Xi-Xi(min)]/[Xi(max)-Xi(min)]×0.5+[1/Xj-1/Xj(min)]/[1/Xj(max)-1/Xj(min)]×0.5

其中，Xi是平均最短路徑長度，Xj是介數。R值越小，節點在網絡中的作用則越重要。

1.3 關鍵靶點的中醫癥狀分類及治療中藥篩選

SymMap數據庫(https：//www.symmap.org)將現代醫學常用的499種草藥、961個中醫癥狀、5 235種疾病、19 595種草藥成分和 302種基因相聯系，構建了一個包含中醫癥狀圖譜的綜合數據庫[9]。本研究中，筆者將3種疾病共有的20個關鍵靶點導入SymMap數據庫，獲得與關鍵靶點相關的中醫癥狀及草藥成分，并構建靶點-中醫癥狀網絡及靶點-成分數據庫。其中，生物利用度OB≥30%的成分被納入網絡分析。

2 結果

2.1 甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤3種疾病共有靶點獲取及通路分析

通過向 DisGeNET、Gencards、CooLGeN 數 據 庫 輸 入“Thyroid nodule”“Breast nodules”及“uterine leiomyomas”等關鍵詞篩選疾病相關靶點，去除重復靶點后，分別獲得甲狀腺結節相關靶基因1 912個，乳腺結節相關靶基因2 332個，子宮肌瘤1 064個。將上述3種疾病的相關靶點取交集發現，甲狀腺結節與乳腺結節的共同靶基因有1 852個，甲狀腺結節與子宮肌瘤的共同靶基因有548個，乳腺結節與子宮肌瘤的共同靶基因有573個。即甲狀腺結節與乳腺結節的相關性可能高于與子宮肌瘤的相關性。如圖1A所示，3種疾病的共同靶基因有537個。

將3種疾病共有的537個作用靶點通過Metascape數據庫進行KEGG通路注釋分析。如圖1B所示，537個靶點主要作用于pathways in cancer、age-rage signaling pathway in diabetic complications、proteoglycans in cancer、cytokine-cytokine receptor interaction、HIF-1 signaling pathway、fluid shear stressand atherosclerosis、non-alcoholic fatty liver disease、estrogen signaling pathway等20條通路，涉及腫瘤、糖尿病、非酒精性脂肪肝、動脈硬化、炎癥反應、缺氧、雌激素信號通路等。

注：1A.甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤3種疾病共有靶點獲取；1B.共有靶點的KEGG分析。

2.2 共有靶點蛋白-蛋白相互作用網絡的構建及關鍵靶點篩選

將537個共有靶點導入String數據庫中，獲取共同靶點蛋白-蛋白相互作用關系。以此為網絡背景，利用Cytoscape 3.7.2 軟件構建網絡。該蛋白-蛋白相互作用網絡共涉及530個節點，18 304條邊。節點表示共有靶基因，邊表示靶蛋白間的關聯。利用Network Analyzer分析得到該網絡的平均Degree值=69.072 61。篩選大于Degree值2倍的靶基因，初步得到61個共有關鍵靶點。為進一步確定這3種疾病的關鍵基因，筆者以R為評分標準，對這61個共有關鍵靶點進一步篩選。如圖2A所示，節點越大，代表該節點Degree值越大，節點的顏色越深，代表該節點的R值越小，即該節點在網絡中的地位越重要。基于Degree值及R值，獲得了3種疾病的20個關鍵作用靶點，具體信息如表1所示。

注：A.61個共有靶點的蛋白-蛋白作用網絡；B.關鍵靶點-中醫癥狀作用網絡。

表1 3種疾病的20個共有關鍵靶點信息

2.3 關鍵靶點的中醫癥狀及治療中藥分析

中醫學提供了大量中藥天然產物用于治療的臨床癥狀信息，這些癥狀對臨床診斷和治療至關重要。SymMap數據庫將中醫癥狀、草藥成分及疾病治療靶點相關聯，為中醫學研究設計方案提供了線索和方向。如圖2B所示，通過檢索SymMap數據庫，獲得16個靶點所對應的154種中醫癥狀。這些中醫癥狀涉及：多種痛癥(頭痛、胸痛、肋痛、肌肉痛、經期產后腹痛等)，腫塊(癭瘤、皮下結節、乳腺增生等)，血癥(斑疹、胃出血、便血、貧血等)，熱證(口瘡、牙齦腫痛、粉刺等)，消化道不適癥狀(脘痞、嘈雜、嘔惡、泛吐清水等)，精神神經癥狀(癲狂、抽搐、昏迷、頭暈目眩等)，頭面五官癥狀(目暗昏花、不能久視、耳聾、脫發)，關節不適(關節腫痛、僵硬、腰膝酸冷)，以及發熱、懶言、浮腫、肥胖、四肢無力等全身癥狀。根據中醫氣血津液辨證，這些癥狀主要涉及血瘀、火熱、痰濕病機。根據中醫臟腑病機辨證，這些癥狀病變部位主要在肝。根據經絡辨證，這些中醫癥狀多見于足厥陰肝經。

通過檢索SymMap數據庫，以OB≥30%為篩選條件，獲得17個關鍵靶點(EGF、EGFR、IL6、INS、MYC、TNF、TP53、VEGFA、FN1、CCND1、ESR1、MMP9、MAPK3、PTEN、SRC、CTNNB1、AKT1)所對應的564個成分。其中，484種中藥成分可能影響ESR1基因的表達。這表明大多中藥治療這3種疾病的分子作用機制可能與調節雌激素受體的生物學效應相關。此外，筆者還發現：影響關鍵靶點數目最多的前4個成分分別是：槲皮素(Quercetin，Degree=13)、木犀草素(Luteolin，Degree=9)、漢黃連素(Wogonin，Degree=7)、漆樹黃酮(Fisetin，Degree=7)。中醫治療疾病往往通過多靶點、多通路發揮作用。本研究發現僅這4個成分即可作用于3種疾病的13個關鍵靶點，影響13個靶點相關的蛋白-蛋白作用網絡。如圖3所示，這13個關鍵靶點所對應的生物學功能涉及：上皮細胞及平滑肌細胞增殖、細胞凋亡、乳腺小泡發育、蛋白磷酸化以及一氧化氮合成。將這4個成分與SymMap數據庫中的中草藥進行匹配，最終獲得263味包含上述成分的草藥。鑒于中醫藥多成分、多靶點治療特色，本研究選出包含≥2個成分的草藥43味。經分析發現：這43味中藥以清熱瀉火解毒、祛濕化痰及化瘀類藥為主，涉及補陽藥、補陰藥及溫里藥。此外，本研究還發現，臨床治療甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤的常用復方(小柴胡湯及桂枝茯苓丸)中的多味中藥含有槲皮素。具體講，柴胡、半夏、人參、甘草、大棗、桂枝、牡丹皮、桃仁均含有槲皮素，黃芩含有漢黃連素。該結果佐證了通過此方法篩選出的中藥針對3種疾病的治療效果。

3 討論

3.1 從現代醫學角度分析3種疾病間的分子機制關系

共有靶點KEGG通路分析顯示，甲狀腺結節、乳腺結節及子宮肌瘤與雌激素信號轉導通路密切相關。研究證實，3種疾病病變組織均異常高表達雌激素受體(Estrogen receptor，ESR1)，高雌激素水平是甲狀腺結節、乳腺結節及子宮肌瘤的共同危險因素[10-12]。應用雌激素受體拮抗劑能抑制甲狀腺腫大及子宮平滑肌增生[13-14]。本研究還發現，這3種疾病與腫瘤通路的激活密切相關。研究發現，甲狀腺功能減退會增加絕經后婦女乳腺癌發生率[15]。乳腺癌患者可檢測到甲狀腺激素及抗體的變化幅度與乳腺癌病變嚴重程度相關[16]。王新云等[17]研究發現，有子宮肌瘤病史的婦女中患乳腺癌的風險增加。此外，本研究還發現這3種疾病與

圖3 關鍵靶點-成分-中藥-功能分析作用網絡

糖尿病、胰島素相關通路也密切相關。研究發現，在女性患者中胰島素抵抗是甲狀腺結節的獨立危險因素[18-19]。胰島素自身亦可促進甲狀腺細胞增殖。胰島素還可通過胰島素生長因子(Insulin-like growth factor I，IGF-1)受體促進甲狀腺細胞的增殖抑制其凋亡[20]。高胰島素血癥及IGF-1對子宮也有類似作用[21]。這些研究提示，上述3種疾病是體內內分泌紊亂的信號，應引起足夠的重視，防止疾病發生及進展。

3.2 從中醫理論角度分析3種疾病間的病因病機關系

甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤分屬中醫“癭瘤”“乳核”“石瘕”范疇，皆為有形實體。清代名醫唐容川云：“積聚之證，此非凝痰，即是黑血”；《丹溪心法》謂：“凡人身上中下有塊者，多是痰”。本研究發現，這3種疾病共有關鍵靶點所匹配的中醫癥狀與血瘀、痰濕、火熱的中醫病機密切相關。血瘀的病機特點為疼痛，痛有定處，甚則可形成腫塊、出血。本研究歸納的癥狀有多種痛癥、腫塊及出血癥狀。濕性重著黏滯，易阻遏氣機，濕邪留滯經脈可致抽搐。濕犯上焦，則咳喘；濕阻中焦，則脘腹脹滿、泛吐清水，脘痞嘔惡；濕滯下焦，則便溏、小便不利；水濕泛溢則致水腫、濕疹、瘙癢。若水濕無以運化，則聚積生痰。隨著病機轉化，痰濕、瘀血均可郁而化火，火性炎上，可見口瘡、粉刺、牙齦腫痛、瘡瘍等癥狀；火擾心神，則五心煩熱。由此推斷，甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤及其他相關疾病是機體血瘀、痰濕、火熱內郁病理狀態的集中體現。若火、痰、瘀之邪日久不散，蓄久化毒，形成熱毒、痰毒、瘀毒，相互兼夾，相互轉化，則這3種疾病易形成變證，嚴重危害健康。

本研究發現，甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤的關鍵靶點所匹配的中醫癥狀主要病位在“肝”。《圣濟總錄·癭瘤門·諸癭統論》云：“憂恚勞氣，郁而不散……此癭所為作也……婦人多有之，緣憂恚有甚于男子也。”可見，氣機郁而不散是癭病的關鍵病機。《外證醫案匯編》曰：“乳癥，皆云肝脾郁結，則為癖核。”《婦科玉尺》云：“婦人積聚之病皆血之所為。蓋婦人多郁怒，郁怒傷肝，而肝藏血者也。”故肝氣郁結是癭病、乳核、石瘕的關鍵成因。再者，肝主疏泄，可助脾運化，助胃受納腐熟，若肝失疏泄，犯脾克胃，則出現脘痞、嘈雜嘔惡、胃脘痛等癥狀。肝喜條達，內寄相火，主動主升，易于陽亢，易于動風。若肝氣升發不及，則兩脅脹痛。若肝氣升發太過，則頭暈目眩、頭痛頭脹、抽搐、驚癇。肝主藏血，若肝不藏血，則可見出血等癥。肝開竅于目，若肝失所養、疏泄不及則目暗昏花、不能久視，視力減退。肝氣升發太過，則目赤翳障。肝藏血，腎藏精，肝腎同源，精血互生。肝主筋，腎主骨；肝腎陰虛，則見關節腫痛、僵硬、骨質增生。《素問·陰陽應象大論》言：“腎生骨髓，髓生肝”，《靈樞·海論》言：“腦為髓之海”，清代陳士鐸《辨證奇聞·卷三》云：“腦氣不足，則肝之氣應之，肝氣大虛，不能應腦”，肝腎不足，則思維遲緩。從經絡角度講，《靈樞·經脈》云：“肝足厥陰之脈……上腘內廉……過陰器，抵小腹，挾胃，屬肝，絡膽，上貫膈，布脅肋，循喉嚨之后，上入頏顙，連目系，上出額，與督脈會于巔；其支者，從目系下頰里，環唇內；其支者，復從肝，別貫膈，上注肺。”足厥陰肝經為肝之外延，甲狀腺、乳腺、子宮均處于足厥陰肝經的循行部位。此外，關節、口唇、咽喉、眼睛、腦、胸脅、肺等部位也為肝經所過。基于以上分析，本研究將3種疾病關鍵靶點所匹配的中醫癥狀主要病位歸于“肝”。由此可知，中醫理論可用現代分子生物學理論部分解釋，該結果進一步證明了靶點-中醫癥狀網絡構建的可行性。

3.3 治療

本研究發現，槲皮素可能對3種疾病均有一定治療作用。研究證實，槲皮素可激活PI3K-AKT通路，抑制甲狀腺細胞生長[22]，逆轉乳腺癌細胞他莫昔芬耐藥[23]。研究發現，低劑量槲皮素還可拮抗雌激素效應，抑制子宮肌瘤細胞增殖[24]。但槲皮素的臨床療效及安全性有待進一步確證。

山東中醫藥大學附屬醫院錢秋海教授認為，甲狀腺結節、乳腺結節、子宮肌瘤均屬內分泌系統紊亂疾病，屬多發結節體質，當以治肝論治。治療此類疾病時，常用小柴胡湯為底方，配以化瘀散結、祛濕化痰、清熱解毒之品。活血散結之品常選用皂角刺、桃仁、丹皮、桂枝、丹參。祛濕化痰之品則根據濕邪所困部位，靈活選用白豆蔻、香薷化濕；黃連、黃芩、黃柏燥濕；石韋、虎杖利濕。肝郁氣滯重者加香附；肝郁化火者加焦梔子、蓮子心、夏枯草；熱毒蘊結者宜用清熱解毒法，常用連翹、金銀花、半枝蓮解毒散結；咽部不適者加山豆根、木蝴蝶；目赤翳障者加木賊、谷精草；皮膚瘙癢、濕疹瘙癢者加白鮮皮、苦參、荊芥。這些臨床經驗用藥與生物信息數據庫歸納結果相近。此外，飲食調節也是多發結節體質治療的關鍵和基礎。多發結節體質患者應少食含碘、含鹽過高、肉類及辛辣刺激食物，倡導患者形成清淡飲食習慣。

綜上，本研究結果提示，對于甲狀腺結節、乳腺結節及子宮肌瘤這3種獨立疾病，應持整體觀念，綜合治療。在臨床診療中，如遇女性甲狀腺疾病患者，除檢查甲功、甲狀腺相關抗體、甲狀腺彩超外，還應囑患者行乳腺彩超、婦科彩超檢查。同時，應提高患者對腫瘤、糖尿病、動脈硬化、酒精性脂肪肝的預防意識。目前，西醫治療這3種疾病雖有一定效果，但有諸多不良反應，而中醫藥可通過多靶點、多途徑治療此類疾病，異病同治，安全可靠。隨著現代信息技術的發展，疾病間的分子關聯網絡將逐步揭示。生物信息技術也必將成為闡釋中醫藥理論的利器，為中醫藥基礎研究及臨床組方提供新思路與新方法。