葛根散治療結腸癌網絡藥理學研究

聶 新，唐東昕

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

現代社會人們不健康的生活方式越來越多，癌癥的發生率也高居不下，據國際癌癥研究機構2021年最新公布的數據顯示[1-2]，預計2020年全球新增結直腸癌患者近193.16萬人，死亡約93.52萬人，死亡率高居癌癥死亡率的第二位。盡管目前現代醫學通過手術、放化療及靶向治療等手段干預結腸癌取得了一定的臨床療效，但治療引起的毒副作用常給患者的生活質量及治療信心帶來消極影響。隨著惡性腫瘤個體化綜合治療的逐步推進與深入發展，中醫藥在配合放化療時的減毒增效作用，以及對腫瘤患者的臨床癥狀、生活質量及生存期等多方面的改善作用逐漸得到了廣泛認可[3]，但其復雜的分子機制仍處于進一步探索當中。

葛根散原為張從正創制的解酒毒之方，記載于《儒門事親》，由葛根、葛花、甘草、貫眾、砂仁組成，具有清熱解毒、行氣化濕、醒脾解酒的功效[4]。研究表明，葛根散能有效抑制結腸腺癌細胞生長，促進其凋亡，并能改善荷瘤小鼠的生存質量[5]；葛根散方中葛根素、槲皮素等多種成分已被證實具有抗腫瘤的功效[6-7]，然而中藥復方治療惡性腫瘤具有多種組分、靶點、通路互作的特點，故本研究將應用網絡藥理學方法來預測葛根散治療結腸癌的潛在分子網絡機制，以期為今后的藥理及臨床研究提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 葛根散有效成分及靶點篩選

分別以“葛根、葛花、甘草、砂仁、貫眾”為關鍵詞在TCMSP數據庫中(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索葛根散的有效成分，設定篩選條件為：口服生物利用率(Oralbioavail ability，OB)≥20%，類藥性(Drug-likeness，DL)≥0.1，并結合文獻資料對葛根散的有效成分進行補充。應用PubChem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索葛根散有效成分對應的SMILES號，并將其導入Swiss Target Prediction數據庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)以預測成分相應靶點，設定Probability≥0.7[8]，所得靶點與TCMSP數據庫中有效成分對應的“Related Target”版塊所示靶點合并去重，最后運用UniProt數據庫(http：//www.uniprot.org/)將獲得的靶標蛋白名稱轉換為相應的基因Symbol。

1.2 結腸癌相關靶點篩選

以“Colon Cancer”為關鍵詞，“Relevance Score≥10”為篩選條件[9]，在GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org/)檢索結腸癌相關靶點。

1.3 葛根散抗結腸癌潛在作用靶點篩選

將葛根散靶點與結腸癌靶點導入Venn在線平臺(Calculate and draw custom Venn diagrams，http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制韋恩圖，以獲取兩者的交集靶點——即葛根散抗結腸癌的潛在作用靶點。

1.4 蛋白互作網絡構建及核心靶點篩選

運用String數據庫(https：//www.string-db.org/)對葛根散抗結腸癌潛在作用靶點進行蛋白互作網絡(PPI Network)分析，設置“Organism=Homo sapiens”“High confidence(0.700)”并隱藏離散的蛋白節點；利用Cytoscape 3.7.1軟件對結果進行拓撲分析并可視化，依據拓撲分析所得的節點度值(Degree)、間距中心度(Betweenness Centrality，BC)以及緊密中心度(Closeness Centrality，CC)篩選出葛根散治療結腸癌的核心靶點。

1.5 葛根散抗結腸癌核心靶點GO及KEGG富集分析

運用Metascape平臺(http：//metascape.org/)對葛根散治療結腸癌的核心靶點進行GO及KEGG富集分析，設置“PValue<0.01”；運用Bioinformatics平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO及KEGG富集分析氣泡圖。

1.6 網絡圖構建

利用Cytoscape 3.7.1軟件繪制“成分-核心靶點-通路”網絡圖，并依據度值篩選出葛根散的主要作用成分。

1.7 化合物-靶點分子對接

運用PubChem數據庫檢索葛根散主要作用成分的2D結構，使用ChemBioOffice軟件將其轉換為3D結構并保存為Mol2格式；在RCSB PDB數據庫(https：//www1.rcsb.org/)檢索葛根散治療結腸癌核心靶點的蛋白結構，導入Pymol軟件去除水分子并分離蛋白及原始配體，運用Autodock Tool軟件將化合物、蛋白及原始配體均轉化為pdbqt格式，最后運用Autodock Vina進行分子對接，運用Pymol進行對接可視化。

2 結果

2.1 葛根散有效成分及相關靶點

通過檢索TCMSP數據庫并結合相關文獻補充后[10-16]共篩選出活性成分216種，其中葛根12種、葛花41種、砂仁28種、貫眾9種、甘草126種，剔除重復部分后得到葛根散活性成分190種。將TCMSP數據庫及Swiss Target Prediction數據庫檢索得到的相關靶點合并去重后共得到葛根散成分靶點425個。

2.2 葛根散治療結腸癌潛在作用靶點

根據關鍵詞及篩選條件在GeneCards數據庫共檢索出結腸癌相關靶點1 556個，將其與葛根散成分靶點一同導入Venn在線平臺繪制韋恩圖(圖1)，得到交集靶點——即葛根散治療結腸癌的潛在作用靶點227個。

圖1 葛根散-結腸癌交集靶點韋恩圖

2.3 PPI網絡分析及核心靶點篩選

應用String數據庫及Cytoscape 3.7.1軟件分析葛根散治療結腸癌的潛在作用靶點并可視化(圖2)；圖中共有224個節點，依據各節點Degree值對其大小及顏色進行調整，節點越大、顏色越深則表示相應Degree值越高，在整個網絡中的作用越重要。依據拓撲分析結果，以節點Degree>2倍Degree中位數(34)及BC、CC大于各自中位數(BC：0.00113829，CC：0.444666445)為標準，篩選出TP53、AKT1、IL-6、INS、MAPK1等共43個核心靶點(表1)，這些靶點可能在葛根散抗結腸癌過程中發揮關鍵作用。

圖2 葛根散-結腸癌交集靶點PPI網絡圖

表1 葛根散抗結腸癌核心靶點拓撲參數

2.4 核心靶點GO及KEGG富集分析

將葛根散治療結腸癌的核心靶點導入Metascape平臺進行GO及KEGG富集分析。GO功能注釋及富集分析結果共涉及1 637條條目，包括膜筏、膜微結構域、轉錄調節復合物、黏著斑、常染色質等48項細胞組分條目，轉錄因子結合、DNA結合轉錄因子結合、激酶結合、蛋白激酶結合等81項分子功能條目，以及調控DNA結合轉錄因子活性、生長因子的應答、細胞遷移的正調控等1 508項生物學過程條目。分別篩選出細胞組分、分子功能、生物學過程3項中P值最小的前20項條目制作氣泡圖(見圖3、圖4、圖5)，圖中縱向軸為對各條目的描述，橫向軸為log(Pvalue)值，氣泡的顏色及面積分別對應P值與富集到的靶點信息(Count)；條目的log(Pvalue)值越大，對應的P值則越小，氣泡顏色偏紅；氣泡面積越大，則該條目富集到的靶點信息越多。

圖3 細胞組分氣泡圖

圖4 分子功能氣泡圖

圖5 生物學過程氣泡圖

核心靶點KEGG信號通路分析共富集到140條信號通路，主要涉及癌癥通路(Pathways in cancer)、癌癥相關蛋白聚糖通路(Proteoglycans in cancer)、膀胱癌通路(Bladder cancer)、前列腺癌通路(Prostate cancer)、胰腺癌通路(Pancreatic cancer)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、結直腸癌通路(Colorectal cancer)等腫瘤信號通路，TNF信號通路(TNF signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)等炎癥相關通路以及與內分泌、心血管、感染性疾病有關的多種類別信號通路。依據信號通路P值由小到大選取前20條制作氣泡圖(圖6)，圖中縱向軸為信號通路釋義，橫向軸為通路相應的-log(pvalue)值；信號通路的-log(pvalue)值越大，則相應P值越小，氣泡顏色偏紅；氣泡面積越大，則該通路富集到的靶點信息越多。

圖6 KEGG信號通路氣泡圖

2.5 “成分-核心靶點-通路”網絡圖的繪制

運用Cytoscape 3.7.1軟件制作“成分-核心靶點-通路”網絡圖(圖7)，左側網絡圖以葛根散中5味中藥為中心節點，綠色節點為中藥間共有成分，黃色節點為葛根特有成分，橘色節點為葛花特有成分，粉色節點為貫眾特有成分，淺紫色節點為砂仁特有成分，藍色節點為甘草特有成分，右側網絡圖中圓形節點為葛根散抗結腸癌核心靶點，方形節點為P值最小的前20條KEGG信號通路。對該網絡圖進行拓撲分析，按Degree值由大到小的葛根散成分節點依次為槲皮素(Quercetin)、金雀異黃素(Genistein)、葛根素(Puerarin)、山柰酚(Kaempferol)、大豆苷元(Daidzein)，這些可能是葛根散治療結腸癌的主要成分。見表2、圖8。

圖7 “成分-核心靶點-通路”網絡圖

表2 葛根散抗結腸癌主要成分

圖8 葛根散核心成分結構圖

2.6 分子對接結果

將葛根散治療結腸癌的主要成分槲皮素、金雀異黃素、葛根素分別與作用核心靶點TP53、AKT1、IL-6、INS、MAPK1進行對接。研究發現，配體與受體對接結合能(Affinity)小于-5.0kcal/mol則提示二者具有較好的結合活性[17]；分子對接結果顯示，槲皮素、金雀異黃素、葛根素與各靶蛋白對接后結合能均≤-5.0kcal/mol，其中各成分與AKT1(PDB ID：3O96)的結合活性更佳。結果見表3、圖9。

表3 分子對接結合能

圖9 分子對接示意圖

3 討論

結直腸癌癥狀與中醫古籍所述“腸蕈”“鎖肛痔”等疾病的癥狀類似，故可將其歸屬于該范疇。劉尚義教授將結直腸癌的中醫病因病機歸納為先天不足、脾腎兩虛，加之飲食失節、情志失調、久居濕地等，而致脾虛失運、濕熱內生、蘊結成毒、濕熱毒邪搏結于大腸[18]。其他醫家亦有各自的見解，一般認為結直腸癌病因病機與正氣虛弱、飲食不當所致脾胃受損、濕熱瘀毒蘊結大腸有關[19]。葛根散出自張從正所著《儒門事親》，原為治療酒傷所致諸癥的常用方劑，具有清熱解毒、行氣化濕之效[4]。國醫大師劉尚義教授以葛根散為基礎方加減創制了具有養陰散結、活血消癥功效的蟾靈膏[20]，用于治療各類良、惡性腫瘤。根據臨床研究顯示，蟾靈膏能改善氣滯血瘀型腸癌患者的臨床癥狀，提高患者生活質量[21]；不過目前有關葛根散治療結腸癌的有效成分、靶點及機制還不十分明確，故本研究運用網絡藥理學方法對其進行進一步探討。

本研究PPI網絡圖中共有224個節點，經拓撲分析篩選出葛根散治療結腸癌核心靶點43個，依據節點Degree值由大到小排名靠前的核心靶點依次為腫瘤蛋白p53(Tumor protein p53，TP53)、蛋白激酶B-α(Protein kinase B alpha，AKT1)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)、胰島素(Insulin，INS)、絲裂原活化蛋白激酶1(Mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)等。腫瘤蛋白p53(TP53)是由抑癌基因p53編碼的一種DNA序列特異性轉錄調節因子[22]，參與轉錄、DNA重組與修復、細胞應激反應、細胞增殖與凋亡及血管生成等多個生物學進程[23]，對防止腫瘤的發生發展具有重要意義，約有60%的結直腸癌患者會出現p53基因突變[24]，從而失去對腫瘤細胞增殖、分化等過程的抑制作用。蛋白激酶B-α(AKT1)作為介導PI3K/AKT信號通路中關鍵的一員[9]，是其上游調節因子PI3K主要的效應對象[25]，活化后的AKT1與細胞的增殖、凋亡、周期調控以及機體葡萄糖代謝等多種生物學過程密切相關[26]；AKT1在結腸癌組織中的表達明顯升高[9]，且升高程度與腫瘤的體積、分期及淋巴結轉移與否呈正相關[27]。白介素-6(IL-6)是由單核巨噬細胞、腫瘤細胞等多種細胞分泌的，能參與免疫調節、炎癥反應及細胞增殖與分化調控等過程的多效炎癥細胞因子，IL-6的失調控可能導致惡性腫瘤發生[28]，其促進增殖及抑制凋亡的作用主要由STAT3介導，STAT3作為IL-6的下游效應因子，可通過上調cyclin D、PCNA、Bcl-xL、Bcl-2等基因及蛋白的表達來抑制細胞凋亡、促進細胞增殖[29]；研究顯示，IL-6的高表達還能通過IL-6/STAT3信號通路引起結腸癌HCT-116/5-FU細胞耐藥[30]；同時IL-6對調控腫瘤炎性微環境也具有重要作用。此外，結腸癌患者血清的IL-6水平顯著升高[31]，故可考慮將其作為判斷結腸癌預后的指標之一[32-33]。胰島素(Insulin)對PI3K/AKT、FoxO、MAPK等信號通路均能起到調控作用，從而影響腫瘤的進展[34-35]。研究證實，胰島素通過上調ACAT1表達促進了結腸癌細胞的增殖與遷移[36]。絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)是調控細胞增殖與分化的關鍵因子，研究證明，下調MAPK1的表達可抑制結腸癌細胞增殖、凋亡與侵襲[37]。

網絡拓撲分析顯示，槲皮素、金雀異黃素、葛根素、山柰酚及大豆苷元可能是葛根散抗結腸癌主要成分；槲皮素是一類天然黃酮醇類化合物。研究顯示，槲皮素通過可調控p53、Caspase-3、Bax、Bcl-2、CDK、MMP-9等多種基因及蛋白的表達來實現抗腫瘤效應[38-40]，且能通過下調P-糖蛋白(P-gp)的表達降低細胞的外排作用，來逆轉腫瘤細胞的耐藥，同時在聯合放化療時有較好的協同作用[41-42]。金雀異黃素、葛根素、大豆苷元為葛根與葛花共有活性成分；金雀異黃素具有十分廣泛的抗腫瘤特性，除了對細胞凋亡、增殖及遷移的影響以外[43]，還可促使LC3I轉化為LC3II，從而誘導結腸癌細胞發生自噬[44]，并能特異性抑制增殖狀態下的血管內皮細胞，通過調節VEGF、EGF、TGF-α、PDGF等來抑制血管生成，是十分安全且有效的血管生成抑制劑。同時，金雀異黃素還可通過抑制酪氨酸蛋白激酶(PTK)、DNA拓撲異構酶II(Topo II)、胰島素樣生長因子I(IGF-1)等多種酶及生長因子的活性來起到抗腫瘤的作用[45]。異黃酮類化合物的主要成分葛根素[46]，同大豆苷元、山柰酚一樣具有明確的抗腫瘤效應[6，45，47，48]。

GO分析結果顯示，葛根散治療結腸癌核心靶點所涉及的生物學過程主要富集在DNA結合轉錄因子活性的調控、對生長因子的應答、細胞遷移的正向調控、血管生成等方面。KEGG分析表明，葛根散對結腸癌的治療作用主要是通過調控癌癥通路、癌癥蛋白多糖通路、TNF信號通路、IL-17信號通路、FoxO信號通路、Toll樣受體信號通路、結直腸癌通路等多信號通路來實現的。白介素-17作為十分重要的促炎因子，可通過激活NF-κB、MAPK信號通路，上調IL-6、TNF、COX-2等多種因子表達來促進腫瘤相關炎癥反應[49]。在腫瘤中，FoxO信號通路與其上游的PI3K/AKT信號通路關系最為密切，FoxO轉錄因子激活后可通過阻滯細胞周期、促進細胞凋亡等方式發揮抗腫瘤效應[50]，但被PI3K激活后的AKT可使FoxO磷酸化并降解，從而引起腫瘤進展。Toll樣受體信號通路的異常激活與結直腸癌的發生亦密切相關，其作用機制之一可能與腸道菌群-Toll樣受體信號通路-炎性反應以及腫瘤級聯反應有關[51]，此外，KEGG信號通路還涉及內分泌、心血管、感染性疾病等多種機制通路，提示葛根散可能對該類疾病同樣具有治療作用。

綜上，葛根散治療結腸癌是通過多組分、多靶點、多通路、多機制的協同作用來實現的，其發揮作用的主要成分可能為槲皮素、金雀異黃素、葛根素、山柰酚及大豆苷元，涉及的靶點主要有TP53、AKT1、IL-6、INS、MAPK1，并通過調節癌癥通路、癌癥蛋白多糖通路、FoxO信號通路等腫瘤通路及TNF信號通路、IL-17信號通路、Toll樣受體信號通路等炎癥通路多途徑發揮抗結腸癌作用，且葛根散主要成分與作用核心靶點間有較好的結合活性。結果表明葛根散治療結腸癌除了發揮促進細胞凋亡、抑制細胞增殖等作用外[5]，還能夠起到調控腫瘤炎癥微環境的作用。腫瘤炎性微環境是導致腫瘤復發、轉移、耐藥的重要原因之一，機體在感受濕熱之邪時往往會出現炎癥細胞浸潤并發生炎癥反應，且“濕熱蘊毒”的病機過程與炎-癌轉化的進程具有一定的相似性且關系密切[52]，故結腸癌發生的病理過程與其中醫病機高度相符；加之葛根散具有清熱解毒、行氣化濕之效，故可推測葛根散對治療結腸癌有較好的療效，但由于本研究僅對篩選出來的葛根散治療結腸癌的核心作用靶點進行了網絡分析，故在探究其作用機制上還存在一定的局限性，還需要對其進行進一步探索，并給予實驗驗證，以更好地挖掘葛根散的臨床作用。