Connexin亞細胞定位與腫瘤發生發展關系的研究進展

莫孝成，沈小菊，莫小香，于 菲，何敬川，譚惟丹，鄧志華，2，陳志泉，陽 潔

(1.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021；2.右江民族醫學院附屬醫院，廣西 百色 533099)

目前，惡性腫瘤已經成為嚴重威脅人類健康和生命的公共衛生問題之一。縫隙連接蛋白(connexin,Cx)作為一類在人類組織器官廣泛表達的跨膜蛋白家族，在腫瘤中的研究已有近60年的歷史，被普遍認為與腫瘤的發生發展密切相關。近年研究發現，Cx在腫瘤細胞中不同的亞細胞定位(細胞膜、細胞質、細胞核、線粒體)與腫瘤細胞不同的惡性表型密切相關。例如，Aasen等[1]研究發現，細胞核中高表達的Cx43是肺癌患者預后不良的生物標志物。Xiang等[2]研究表明，肝細胞癌細胞質中高表達的Cx32可激活表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號通路發揮抗凋亡作用。目前，將Cx及其形成的GJ、HC作為腫瘤的治療靶點已經成為當今腫瘤研究領域的熱點，如目前已經獲批針對糖尿病足潰瘍進入Ⅲ臨床試驗階段的藥物αCT1，其靶向Cx43與閉合小帶蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)的相互作用，從而促進Cx43在細胞膜形成GJ，促進傷口愈合。該藥被證實能夠克服膠質母細胞瘤的替莫唑胺耐藥，然而由于Cx的亞細胞定位調控因素的多樣性、不同類型腫瘤組織中Cx分布的特異性、以及腫瘤發生發展不同階段的復雜性，使得靶向Cx及其形成的縫隙連接通道(gap junction,GJ)、半通道(hemichannel,HC)的腫瘤治療研究仍然受到諸多阻礙。

最新研究表明，Cx的亞細胞定位影響其合成、轉運、翻譯后修飾等多種因素的調控。其中，翻譯后修飾(包括磷酸化、泛素化和乙酰化等)對Cx亞細胞定位的影響備受關注。因此，我們通過從Cx的分類、功能及其亞細胞定位與腫瘤發生發展的關系以及翻譯后修飾對Cx亞細胞定位進行綜述，以期為將Cx作為抗腫瘤治療的干預靶點提供參考。

1 縫隙連接蛋白

1.1 Cx的分類及分布從1963年Robertson等[3]首次在金魚的大腦中發現GJ通道，到1987年Beyer等[4]對第一個Cx即Cx43編碼基因的克隆，迄今為止人類共發現了21種Cx。Cx根據分子量命名，如分子量為43 ku的Cx命名為Cx43。根據同源性Cx分為α、β、γ、δ和ε等5個亞型，例如Cx43屬于α亞型、Cx32屬于β亞型。Cx在人類的組織器官中廣泛表達并具有一定組織特異性。如肺主要表達Cx26、Cx32、Cx31.1和Cx43[5]，而神經系統中主要表達Cx43[6]。

1.2 Cx的結構、功能及亞細胞定位Cx是一種跨膜蛋白，其結構中除了具有4重跨膜區段外，還包括氨基端、兩個胞外環、一個胞內環和羧基端：(1)氨基端高度保守，主要調控GJ的開放和關閉。(2)同樣保守的胞外環主要負責相鄰細胞間GJ的對接。(3)胞內環差異較大，參與PH門控通道的調節。(4)羧基端是Cx的長度和氨基酸序列差異最大部位，可與細胞質的多種激酶、細胞骨架蛋白和緊密連接蛋白結合，如肉瘤(sarcom,SRC)激酶家族、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)、Ⅰ型酪蛋白激酶(casein kinase1,CK1)、β微管蛋白(β-tubulin)、閉合小帶蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)等。翻譯后修飾如磷酸化、泛素化、乙酰化等也主要發生在Cx的羧基端。

Cx能夠定位在細胞膜、細胞質和細胞核，根據其亞細胞定位的不同，Cx的功能主要可分為以下4種：(1)6個Cx在細胞膜上形成HC從而進行細胞質與細胞外環境之間的物質交換；(2)兩個相鄰細胞膜的HC對接形成GJ，介導縫隙連接細胞間通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)，從而進行相鄰細胞之間的分子量<1.5 ku的物質交換(如ATP、cAMP、Ca2+)[6]；(3)Cx本身通過細胞質的羧基末端與不同蛋白分子結合從而發揮信號樞紐作用[7]；(4)Cx發生核轉位，進入細胞核發揮轉錄因子功能，調控細胞的遷移[8]。

2 Cx亞細胞定位與腫瘤發生發展的關系

腫瘤的發生和發展是受到多種因素驅動的復雜過程，主要表現為腫瘤細胞無限制的增殖、凋亡抵抗、侵襲、轉移和耐藥等。Cx在腫瘤細胞的不同亞細胞定位(細胞膜、細胞質、細胞核、線粒體)與腫瘤細胞的增殖、凋亡、壞死、侵襲、轉移、耐藥和干細胞特性密切相關，Cx異常的亞細胞定位往往會促進腫瘤的發生發展。

2.1 細胞膜Cx與腫瘤侵襲、轉移和耐藥的關系許多人類疾病包括腫瘤都與異常的膜蛋白功能有關，膜蛋白是目前靶向抗腫瘤藥的主要靶點，如人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)。以往研究認為，細胞膜的Cx通過形成GJ抑制腫瘤的惡性進展。例如，天然化合物蘿卜硫素(sulforaphane,SF)通過增加胰腺癌細胞膜的Cx43表達，形成GJ介導GJIC從而通過“旁觀者效應”增加胰腺癌對吉西他濱的化療敏感性[9]。然而，近年來大量研究報道，腫瘤細胞膜表達的Cx也能通過形成GJ或HC促進腫瘤的侵襲、轉移。2016年《Nature》一篇文章報道[10]，乳腺癌和肺癌細胞表達的原鈣黏蛋白7(protocadherin7,PCDH7)可促進Cx43在癌細胞與星形膠質細胞之間形成GJ。腦轉移癌細胞利用GJ將第二信使cGAMP傳遞到星形膠質細胞，激活STING通路并產生炎性細胞因子IFNα和TNFα，兩者作為旁分泌信號激活腦轉移癌細胞的STAT1和NF-κB通路，從而促進腦轉移癌細胞的生長和化療耐藥。縫隙連接調節劑甲氯芬酯和托那博沙能打破這種旁分泌循環，這為乳腺癌和肺癌的腦轉移提供了新的治療策略。Godinho-Pereira等[11]發現，將乳腺癌細胞與腦微血管內皮細胞混合培養后，最初定位在細胞核周圍的Cx43逐步分布到細胞膜并參與乳腺癌的腦轉移。我們近年的研究也表明[12]，非小細胞肺癌與腫瘤相關成纖維細胞細胞膜的Cx43可形成異質性GJ，介導兩種細胞代謝偶聯，促進NSCLC發生上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和侵襲轉移。除了形成GJ，Cx43還可以在乳腺癌細胞的細胞膜形成HC，通過自分泌嘌呤能信號誘導乳腺癌細胞的集體侵襲[13]。上述研究表明，聚集在細胞膜的Cx43能夠增加胰腺癌細胞對化療藥物的敏感性，但能夠促進乳腺癌、肺癌細胞的侵襲和轉移。這提示Cx43在不同腫瘤類型中，有著促癌或者抑癌的雙重作用。Cx定位在細胞膜形成的GJ能夠增強化療藥物的“旁觀者效應”，從而增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。然而，GJ和HC功能的增強卻可能促使腫瘤細胞代謝變得更加活躍，從而增加了侵襲和轉移的能力。

2.2 細胞質的Cx與腫瘤增殖、耐藥、干細胞特性和壞死的關系許多研究表明，多數細胞質的Cx可促進腫瘤的發生發展。Iikawa等[14]發現與野生型的Cx26相比，帶有內質網滯留信號AKKFF氨基酸序列的突變型Cx26定位在細胞質，促進人下咽鱗癌細胞的生長、侵襲和裸鼠成瘤。三陰性乳腺癌細胞質的Cx26能與干細胞轉錄因子Nanog、局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)形成復合體以維持腫瘤干細胞特性[15]，而干細胞特性的維持促進了腫瘤的異質性和腫瘤耐藥。我們也研究發現，非小細胞肺癌細胞質的Cx26可與PI3K/AKT信號通路互相激活，誘導非小細胞肺癌細胞發生EMT，促進其對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)吉非替尼耐藥[5]。與之相反，非小細胞肺癌細胞質的Cx43負調控PI3K/AKT通路促進對吉非替尼的獲得性耐藥[16]。Xie等[17]研究證實，去甲腎上腺素通過上調Cx32在細胞質的表達促進了非小細胞肺癌對EGFR-TKI阿法替尼的耐藥性。此外，肝細胞癌中Cx32積累在細胞質，通過其羧基端與SRC結合激活EGFR信號通路，抑制化療藥物鏈黑菌素誘導肝癌細胞的凋亡[2]。另外，還有研究報道，肝癌細胞胞質過表達的Cx32通過結合SRC并增強SRC對Caspase8的抑制作用，從而在體外體內加劇紫草素誘導的肝癌細胞壞死性凋亡[18]。以上研究表明，Cx26的細胞質定位能夠促進下咽鱗癌的增殖和非小細胞肺癌、乳腺癌的干細胞特性，Cx32的細胞質定位能夠促進非小細胞肺癌和肝癌細胞的耐藥。

2.3 細胞核Cx與腫瘤預后的關系近年一些研究發現，Cx除了形成GJ、HC發揮經典功能外，還可進入細胞核發揮轉錄輔激活因子的新功能，協同轉錄因子對下游基因的轉錄激活[8]。在腫瘤研究領域，有關細胞核Cx的功能和機制研究很少，處于起步階段。已有研究顯示，Cx也能進入細胞核，并且影響腫瘤的預后。例如，Aasen等[1]檢測了50例肺腺癌和23例肺鱗癌的臨床標本，發現Cx43在細胞核高表達并與更短的總體生存期正相關。此外，Zhao等[19]證實Cx32在宮頸癌組織細胞核的表達高于正常宮頸組織，并可能上調EGFR抵抗順鉑誘導的凋亡。以上研究表明，Cx的細胞核定位預示著肺癌和宮頸癌較差的預后。

2.4 線粒體Cx與腫瘤凋亡的關系線粒體作為細胞能量供應和代謝的中心，對腫瘤凋亡的調控發揮著重要作用。研究表明，腫瘤細胞細胞質的Cx能夠發生線粒體轉位，促進腫瘤細胞的凋亡。例如，Uzu等[20]等研究發現，舒尼替尼作用間皮瘤細胞后，Cx43定位于線粒體并通過激活JNK增強Bax的活性誘導間皮瘤細胞凋亡。由此可見，抗腫瘤藥物作用之后，Cx43能夠定位在線粒體誘導間皮瘤細胞的凋亡。但目前關于抗腫瘤藥物促使Cx轉位于線粒體的具體機制仍未明確，是否能夠將線粒體的Cx作為腫瘤治療靶點需要進一步的研究。

3 翻譯后修飾調控腫瘤細胞的Cx亞細胞定位

越來越多的證據表明，磷酸化、泛素化、類泛素樣修飾蛋白(SU-MO)化、乙酰化、S-亞硝基化等翻譯后修飾能夠影響腫瘤相關蛋白的亞細胞定位，如腫瘤蛋白p53的乙酰化修飾能增強其細胞核定位，引起其下游Bax的激活從而誘導腫瘤細胞凋亡。研究表明，翻譯后修飾也能影響Cx的亞細胞定位，對Cx行使GJ、HC功能，以及非通道(GJ、HC)依賴功能具有十分重要的意義。

Tab 1 Relationship between subcellular localization of Cxs and tumor phenotypes

3.1 磷酸化修飾磷酸化修飾是蛋白質翻譯后修飾最主要的形式之一，在多種腫瘤發生發展過程中發揮重要的調控作用。據文獻報道，Cx43的羧基端已有超過十幾個位點能夠發生磷酸化，包括Y247、S262、Y265、S279/282、S325/328/330、S365、S368和S373等[21]。Solan等[22]通過構建胰腺癌動物模型發現，與癌旁組織相比，癌組織中Cx43羧基端尾部的S325、S328和S330絲氨酸位點被CK1磷酸化后，癌組織細胞膜的Cx43減少，減輕了腫瘤轉移負荷。與此相反，Wang等[23]發現，在結直腸癌細胞中白藜蘆醇上調Cx43的磷酸化水平和細胞膜定位，可以增強GJ功能從而增加西妥昔單抗的抗腫瘤活性。以上研究表明，磷酸化修飾可影響Cx的細胞膜定位并影響腫瘤的轉移和對化療藥物的敏感性，但其對化療藥物敏感性的影響與具體的腫瘤類型有關。

3.2 泛素化修飾泛素化修飾是真核細胞中重要的蛋白質翻譯后修飾方式之一，通過靶向蛋白質降解或其他信號途徑參與細胞多種生理進程，其能使Cx從細胞膜內化到細胞質或細胞核，減少GJ形成及其介導的CJIC，從而增強腫瘤細胞增殖、遷移及對化療藥物的抵抗能力。例如，Totland等[24]在宮頸癌細胞HeLa和C33A發現一種E3泛素蛋白連接酶——神經前體細胞表達發育下調蛋白4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4, NEDD4)能誘導Cx43的泛素化，使得Cx43表達下調和細胞膜定位減少，過表達NEDD4后Cx43定位于細胞核周圍，造成GJ的缺失。此外，缺氧條件刺激下，非小細胞肺癌細胞膜的Cx26和Cx43發生泛素化轉位到細胞質，激活p53/MDM2信號通路從而促進癌細胞增殖、EMT和遷移[25]。在人卵巢癌細胞中，倘若用特異性抑制劑IU1或者小干擾RNA抑制泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific peptidase 14，USP14)可增強Cx32的泛素化，使Cx32由細胞膜內化到細胞質并削弱CJIC，促進人卵巢癌細胞A2780對順鉑的耐藥[26]。研究結果均表明，泛素化對Cx的影響是使其從細胞膜內化到細胞質，減少GJ，削弱GJIC，從而增強腫瘤細胞增殖、遷移及對化療藥物的耐藥，促進腫瘤的惡性進展。這提示我們干預Cx的泛素化修飾在腫瘤治療研究中具有重要意義。

3.3 SU-MO化修飾與泛素化修飾類似，SU-MO化參與多種病理生理條件下的細胞生物學過程。近年研究發現，SU-MO化能調控腫瘤細胞Cx的亞細胞定位和功能，從而影響腫瘤對藥物的敏感性。例如，Zhang等[27]報道Cx43的SU-MO化減少了其膜定位從而削弱GJIC，而沉默泛素結合酶9(ubiquitin-conjugating enzyme9,Ubc9)的表達可增強GJIC功能，并且增加骨肉瘤對化療藥物單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/丙氧鳥苷(substrateⅠof herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir，HSV-TK/GCV)的敏感性。然而，SUMO化對于Cx43的亞細胞定位及其功能的影響可能取決于腫瘤的類型。Shen等[28]研究指出，在肝癌細胞中Cx43的SU-MO化能夠增加其細胞膜定位并增強GJIC功能，提高肝癌細胞對HSV-TK/GCV的敏感性。因此，跟據腫瘤組織類型的不同，SU-MO化的調控作用具有兩面性。其能夠增加或減少腫瘤細胞中Cx43的膜定位，進而增強或抑制GJIC功能，影響腫瘤對化療藥物的敏感性。

3.4 乙酰化修飾蛋白質乙酰化修飾作為翻譯后修飾的重要方式，其過程主要由乙酰轉移酶(HATs/KATs)和去乙酰化酶(HDACs/ KDACs)共同調控。近年來，腫瘤細胞中Cx的乙酰化修飾受到關注。例如，在宮頸癌HeLa細胞，使用曲古霉素A(trichostatin A,TSA)抑制組蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)的活性后，Cx43的乙酰化增加而膜定位相應減少[29]。以上研究表明乙酰化修飾能夠減少腫瘤細胞中Cx的膜定位，然而這種作用對腫瘤表型的影響研究還較少，具體的機制也尚未明確。

3.5 S-亞硝基化修飾S-亞硝基化由一氧化氮(NO)介導，NO通過與半胱氨酸發生共價結合形成S-亞硝基從而調控蛋白的構象、功能和蛋白間的相互作用。研究表明，異丙腎上腺素促進心肌細胞的NO生成，NO結合Cx43羧基端的271位半胱氨酸使其發生S-亞硝基化，從而使Cx43定位在細胞膜的一側形成HC[30]，這表明S-亞硝基化也是影響Cx亞細胞定位的重要因素，但在腫瘤領域有關S-亞硝基化對Cx亞細胞定位的影響的研究還尚未見報道。

4 小結與展望

越來越多的研究證實，Cx在腫瘤細胞中不同的亞細胞定位決定其不同的功能，如發揮GJ或HC功能，以及非通道(GJ、HC)依賴功能，從而調控腫瘤細胞增殖、凋亡、壞死、侵襲、轉移、耐藥和干細胞特性等，在腫瘤的發生發展中發揮關鍵作用。但是，由于Cx的亞細胞定位調控因素的多樣性、不同類型腫瘤組織中Cx分布的特異性、以及腫瘤發生發展不同階段的復雜性，Cx的亞細胞定位及其功能與腫瘤惡性生物學表型之間的關系、具體的分子機制都需要進一步深入研究。