miR-124靶向ZEB2對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

方 卉，楊俊發(fā)，姚 瑤，蔣 啟，路正東，王根寶

(1. 杭州師范大學附屬醫(yī)院，浙江 杭州 310015；2. 安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，安徽 合肥 230032；3.浙江大學醫(yī)學院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州 310006；4.安徽醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，安徽 合肥 230032)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在惡性腫瘤中的發(fā)病率和致死率排全球前五[1]。在中國，因腫瘤死亡的患者大多數(shù)由肝癌導致的[2]。目前，初期診療、手術和介入診療、靶向藥物治療已經(jīng)成熟應用于臨床上肝癌的治療，但是每年仍有幾十萬人因肝癌死亡[3]；表明肝癌的初期診斷和治療迫在眉睫[4]，因此進一步了解其發(fā)生機制可能有助于肝癌的治療。MicroRNA (miRNA)是一種小的內源性非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過結合目標信使RNA (mRNA)的3 '非翻譯區(qū)域(UTR)負調控蛋白質翻譯的RNA。哺乳動物miRNA參與了多種生物學過程，如分化、增殖、抗氧化應激和腫瘤抑制[5]。更重要的是，最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-124在多種腫瘤中表達降低，例如肝癌、乳腺癌等，并且其參與了許多生物學過程，例如遷移、增殖、周期、凋亡和自噬等過程，表明miR-124與腫瘤的發(fā)病機制密切相關[6-7]。E盒結合鋅指蛋白2(ZEB2)屬于E盒結合鋅指蛋白基因家族。有研究發(fā)現(xiàn)，ZEB2可以調節(jié)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，間接調節(jié)腫瘤的進程，包括非小型細胞癌，肺癌和肝癌[8]。本研究旨在明確miR-124與ZEB2的靶向關系，探討miR-124對肝癌細胞增殖，遷移和侵襲的影響，為治療HCC提出新的診斷標志物和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 主要儀器，試劑和細胞系肝癌細胞株HepG2和正常肝細胞株L-02(安徽醫(yī)科大學)；雙熒光素酶試劑盒(美國Promega公司)；Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒(上海BestBio生物公司)、ZEB2，MMP2，MMP9和PCNA抗體(中國武漢proteinech公司)、顯影液(美國Millipo公司)、細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板(中國Nest生物公司)、Transwell小室(美國Thermo Fisher公司)、LippfectamineTM200(美國英杰公司)、TRIzol Reagent RNA 提取試劑(美國Sigma公司)、PVDF膜(德國MERCK公司)、脫脂牛奶(上海光明公司)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(中國BI公司)、miR-124 mimics，miR-124 inhibitor，ZEB2 siRNA，ZEB2質粒(上海GenePharma公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)在高糖培養(yǎng)基(10% FBS)中復蘇凍存細胞，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的細胞孵育箱中；當密度高于90%時，消化細胞并傳代，后續(xù)根據(jù)實驗需求進行處理。

1.3 臨床樣本獲取收集6例HCC患者的肝癌組織和癌旁組織，癌旁組織為正常對照肝組織。 所有樣本采集自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，所有患者均知情同意，得到安徽醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.4 細胞分組與轉染HepG2細胞被分為空白組，陰性對照組(miR-124 NC、ZEB2-NC和Vector)，miR-124 inhibitor組，miR-124 mimics組，ZEB2-siRNA組，ZEB2質粒組(ZEB2-OE)。采用LipfeetamineTM2000進行轉染，6 h后，進行換液，24 h或者48 h后，根據(jù)實驗需求處理已轉染的細胞。

1.5 qRT-PCR首先對用TRIzol法提取的RNA濃度進行測定，然后根據(jù)TaKaRa逆轉錄試劑盒說明進行操作，將RNA反轉錄為cDNA，并按照SYBR Premix Ex TaqⅡ加樣體系，再對所得的DNA進行實時定量PCR擴增。在CFX96實時熱循環(huán)儀進行檢測。采用U6/GAPDH反應后采用2-ΔΔCt法計算RNA的量，各基因引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primers involved in qRT-PCR

1.6 細胞周期檢測轉染48 h后，用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌收集的樣本細胞(1×106～5×106)兩次，并在預冷的70%～75%冰凍乙醇固定。隨后，用冷PBS洗滌細胞1次。用200～500 μL冷PBS重懸細胞。加入RNase A 溶液20 μL 37 ℃水浴30 min。加入 400 μL PI染液溶液，緩慢混合后在4 ℃避光孵育30～60 min。流式細胞術檢測細胞周期變化。激發(fā)波長為488 nm。使用合適的分析軟件進行分析。

1.7 細胞侵襲能力檢測將1×104個細胞接種到無血清的高糖培養(yǎng)基的Transwell小室上層。在侵襲實驗中，上層聚碳酸酯膜上接種上Matrigel 基底膠。將600 μL含10%血清的DMEM細胞培養(yǎng)液加入下層。培養(yǎng)24 ～48 h后，用0.1%結晶紫染色20 min，并且顯微鏡下計數(shù)跨膜細胞。

1.8 細胞劃痕實驗將細胞鋪至6孔板中，轉染結束后，用無菌的黃色槍頭在6孔板的中央輕輕劃痕，劃痕后，用PBS清洗，然后加入無血清的高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，48 h后，在顯微鏡下觀察并拍照，劃痕愈合率越高表明細胞遷移能力越高。

1.9 CCK-8將轉染后細胞接種到96孔板中，培養(yǎng)基體積為100 μL。在培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后，向每孔內加入10 μL CCK-8反應溶液。4 h后，采用酶標儀檢測每孔吸光度(450 nm)。

1.10 雙熒光素酶報告實驗利用生物信息學的預測軟件對miR-124的靶基因進行預測，結果顯示，ZEB2可能是miR-124的靶基因。根據(jù)預測結合位點，ZEB2野生型(ZEB2-WT)和突變型(ZEB2-MUT)熒光素酶質粒購買于湖南長沙贏潤生物；采用LipfeetamineTM2000 將ZEB2-WT、ZEB2-MUT和miR-124 mimics轉染到HepG2細胞中，24 h后，使用 Dual Luciferase 試劑盒檢測各組熒光強度。

1.11 Western blot轉染24 h后，將收集的細胞進行充分裂解(RIPA裂解液)，提總蛋白；用Pierce BCA Protein檢測蛋白濃度；然后通過SDS-PAGE分離，然后轉移到PVDF膜上(GE Healthcare Life Science)。用5%脫脂牛奶阻斷膜1 h，用各自的一抗過夜，用二抗(小鼠或兔)孵育1 h，然后進行化學發(fā)光檢測。用ImageJ軟件定量分析曝光結果，以β-actin為內參。計算ZEB2、PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達量。

2 結果

2.1 miR-124和ZEB2在肝癌細胞系HepG2中的表達水平采用qRT-PCR檢測miR-124在人肝癌細胞系HepG2和人正常肝細胞系L-02中的表達，結果表明，HepG2細胞中miR-124水平相比于L-02細胞明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IHC和Western blot檢測ZEB2的表達變化，結果顯示，ZEB2在肝癌組織和HepG2細胞中的表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這些數(shù)據(jù)表明miR-124在肝癌細胞中地表達，ZEB2在肝癌細胞中高表達，且miR-124與ZEB2呈負相關，見Fig 1。

2.2 miR-124對HepG2細胞增殖和凋亡的影響CCK-8的結果顯示，與miR-124 NC組相比，HepG2細胞的增殖活性因miR-124 mimics明顯被抑制；而miR-124 inhibitor明顯促進了HepG2細胞的增殖活性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此外，通過流式細胞術的結果可以看到，S+G2/M期的細胞比例因miR-124 mimics明顯降低(P<0.05)。Western blot檢測PCNA蛋白表達，結果顯示，與miR-124 NC組相比，HepG2細胞中PCNA蛋白的表達因miR-124 mimics明顯被抑制；而HepG2細胞中PCNA蛋白的表達因miR-124 inhibitor明顯被促進，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，過表達miR-124明顯抑制HepG2細胞的增殖活性，沉默miR-124明顯促進HepG2細胞的增殖活性，見Fig 2。

2.3 miR-124對HepG2細胞侵襲和遷移的影響Transwell檢測轉染miR-124 mimics和miR-124 inhibitor的HepG2細胞侵襲能力，結果顯示，與miR-124 NC組比較，miR-124 mimics組的細胞個數(shù)明顯降低；而miR-124 inhibitor組細胞個數(shù)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。劃痕實驗檢測細胞遷移能力；結果顯示，與miR-124 NC組相比，在miR-124 mimics組劃痕的愈合率明顯降低，而miR-124 inhibitor組的劃痕愈合明顯提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot檢測MMP2和MMP9蛋白表達，結果顯示，與miR-124 NC組相比，miR-124 mimics明顯抑制MMP2和MMP9蛋白表達；而miR-124 inhibitor明顯增加MMP2和MMP蛋白表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，過表達miR-124明顯抑制HepG2細胞侵襲和遷移能力，沉默miR-124明顯提高HepG2細胞侵襲和遷移能力，見Fig 3。

Fig 1 Expression of miR-124 and ZEB2

2.4 miR-124與ZEB2的靶向關系根據(jù)靶基因預測軟件預測miR-124的靶基因，結果顯示ZEB2可能是miR-124的靶基因，ZEB2 3′-UTR結合位點或突變位點序列，見Fig 4A。為了從功能上證明這一點，我們用ZEB2 3′-UTR熒光素酶報告基因轉染HepG2細胞，結果表明，共轉染miR-124 NC和ZEB2-3′-UTR組細胞中熒光素酶活性為(10.30±0.61)，共轉染miR-124 mimics和ZEB2-3′-UTR組細胞熒光活性為(2.459±0.38)，低于共轉染miR-124 NC和ZEB2-3′-UTR組(P<0.05)；共轉染miR-124 NC和ZEB2-MUT組細胞中熒光素酶活性為(11.13±0.48)，共轉染miR-124 mimics和ZEB2-MUT組細胞熒光活性為(10.85±0.93)，與共轉染miR-124 NC和ZEB2-WT組比較無差異，見Fig 4B；轉染miR-124 mimics和miR-124 inhibitor后用qRT-PCR和Western blot檢測ZEB2蛋白表達變化，結果顯示，與miR-124 NC組相比，miR-124 mimics組ZEB2表達水平明顯降低；相反miR-124 inhibitor組表達水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見Fig 4C和4D。因此，ZEB2是miR-124的有一個潛在靶點，證實了mi-124與ZEB2的靶向關系。

Fig 3 Effect of miR-124 on HepG2 invasion and migration n=3)

Fig 4 ZEB2 is a functional target of miR-124 n=3)

2.5 ZEB2對HepG2細胞增殖的影響CCK-8和流式細胞術檢測將ZEB2-siRNA和ZEB2質粒轉染進入HepG2細胞后細胞的增殖活性。CCK-8結果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA明顯抑制HepG2細胞的增殖活性，而ZEB2質粒明顯促進HepG2細胞的增殖活性，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此外，流式細胞術結果顯示，ZEB2-siRNA明顯降低S+G2/M期細胞比例，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot檢測PCNA蛋白表達，結果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA明顯抑制PCNA蛋白表達；而ZEB2質粒明顯促進PCNA蛋白表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，沉默ZEB2明顯抑制HepG2細胞的增殖活性，過表達ZEB2明顯促進HepG2細胞的增殖活性，見Fig 5。

Fig 5 Effect of ZEB2 on HepG2 proliferation and apoptosis n=3)

Fig 6 Effect of ZEB2 on HepG2 invasion and migration n=3)

2.6 ZEB2對HepG2細胞侵襲和遷移的影響結果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA組細胞數(shù)量明顯降低；而ZEB2質粒組細胞數(shù)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。劃痕實驗檢測細胞遷移能力，結果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA組的劃痕愈合率明顯降低，相反ZEB2質粒組中明顯提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot檢測細胞中MMP2和MMP9蛋白表達，結果顯示，與對照組相比，ZEB2-siRNA明顯抑制MMP2和MMP蛋白表達；而ZEB2質粒明顯促進MMP2和MMP蛋白表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，沉默ZEB2明顯抑制HepG2細胞侵襲和遷移能力，過表達ZEB2明顯提高HepG2細胞侵襲和遷移能力，見Fig 6。

3 討論

肝癌是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌，屬于惡性腫瘤。目前一線的治療方法是手術切除和肝臟移植，但由于肝癌具有較高的轉移性和耐藥性導致預后較差，降低肝癌患者的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)迫在眉睫。因此，需要進一步闡明肝癌的發(fā)病機制，從而找到更多有效的診斷和治療方法[9]。miRNAs是一類高度保守的組織特異性非蛋白編碼小RNA，通過負性基因調控維持細胞穩(wěn)態(tài)。適當控制miRNA的表達是一個平衡的生理環(huán)境所必需的。越來越多的研究表明，miRNA在人類疾病中起著關鍵作用[10-11]。此外，多項研究表明，miRNA表達的反常通過充當腫瘤抑制因子和致癌基因與各種癌癥密切相關，間接調控癌癥的進程，例如生長、凋亡、遷移和侵襲等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-124表達水平在肝癌中明顯降低，并且HepG2的遷移和侵襲能力，增殖能力明顯被miR-124 mimics抑制，其惡性程度也會隨之降低。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-124表達在肝癌組織中減少，并且水通道蛋白3的表達可明顯被miR-124 mimics抑制，進而誘導肝癌細胞增殖及遷移能力的降低。有趣的是，本實驗的結果與Chen發(fā)現(xiàn)的一致。此外，之前的研究也發(fā)現(xiàn)，SMMC-7721細胞和BEL-7404細胞的遷移和侵襲能力可以被miR-124抑制[14]。這些結果表明，miR-124是了解和治療肝癌發(fā)病機制的一個新的診斷和治療靶點。

EMT是上皮細胞失去頂基極性和細胞間黏附，向侵襲性間充質細胞過渡的過程。EMT涉及許多生物學和病理過程，包括胚胎發(fā)育、傷口愈合、癌細胞轉移和耐藥性。MiRNA 主要通過和下游靶基因的3′-UTR結合，進而抑制靶基因的表達，從而影響惡性腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和EMT。ZEB2作為EMT激活分子，促進腫瘤進展的主要驅動因素。研究表明，ZEB2和乳腺癌、肺腺癌、大腸癌等惡性腫瘤的發(fā)展和轉移密切相關[15]。本實驗在HepG2細胞中ZEB2對HepG2細胞凋亡、增殖、遷移，侵襲和EMT的作用及miR-124對ZEB1的調控作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，抑制ZEB2表達會促進細胞凋亡和增殖，ZEB2通過調控E-cadherin和Vimentin蛋白表達抑制細胞克隆的形成、遷移和侵襲。為更進一步探究上游調控的miRNA，我們通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)ZEB2是miR-124的潛在靶點。因此，我們選擇miR-124作為我們的研究對象。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-124通過靶向于ZEB2進而抑制EMT和誘導肺癌細胞凋亡來抑制肺癌細胞的遷移和侵襲。本實驗中，雙熒光素酶實驗和Western blot結果證實了miR-124可靶向作用于ZEB2進而抑制ZEB1表達。首次闡明了miR-124通過與ZEB2的3′-UTR相互作用，調控肝癌的增殖、凋亡、遷移，侵襲和EMT。

綜上，本研究通過體外實驗證明，miR-124促進HCC細胞的凋亡和抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力，推測其通過下調ZEB2表達誘導腫瘤細胞EMT發(fā)生而抑制HCC的侵襲和轉移，為HCC轉移機制的深入研究及臨床治療提供新的潛在靶點。