缺血性腦損傷實驗動物模型制備及評價

張 雯，杜立達，宋俊科，杜冠華

(中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050)

腦卒中是人類致死和致殘的主要病因之一，《美國心臟學會2020年心臟病和卒中統計報告》顯示，由于人口老齡化和風險因素的積累，卒中平均終生風險由1990年的22.8%增加至2016年的24.9%[1]。《中國心血管健康與疾病報告2020概要》推算我國腦卒中患病人數為1 300萬，遠高于冠心病和心力衰竭[2]。

實驗動物疾病模型是研究人類疾病病理機制、治療方法、藥物療效和藥理作用的重要條件，建立能夠反映人類生理、病理和藥理特點，且重復性良好，指標嚴格可控的實驗動物模型，對腦血管疾病的研究意義重大。在實際科研工作中，針對不同的研究內容，選擇合適的動物模型，是實現研究目標的重要保障。

1 常用腦缺血實驗動物模型主要類型

目前在臨床前實驗中應用的腦缺血實驗動物模型種類很多，根據不同的分類方法，主要分為以下類型。

1.1 根據缺血程度分類根據腦缺血程度不同，可以分為急性腦缺血、慢性腦缺血、完全性腦缺血、局灶性腦缺血、低灌注性腦缺血、缺血/再灌注等。不同的模型可以反映人類腦缺血的不同疾病特點，可以用于不同機制研究。一般對于卒中的研究，常用急性局灶性腦缺血或急性局灶性腦缺血/再灌注模型。

1.2 根據缺血部位分類目前常用的腦缺血動物模型根據發生部位不同，可分為全腦缺血、彌散性腦缺血和局灶性腦缺血。全腦缺血動物模型主要用于慢性缺血研究，急性全腦缺血動物模型可以用于損傷和保護機制的研究。局灶性缺血是研究腦卒中的主要模型，也是近年來研究最多的實驗動物模型，在缺血性腦卒中的臨床前研究中應用廣泛。彌散性腦缺血主要用于慢性腔隙性腦缺血的研究，但制備方法仍有一定局限性。

2 腦缺血動物模型的制備方法和特點

腦缺血動物模型種類很多，制備方法各有不同，有些模型制備簡單，成功率高。有些模型制作過程復雜，操作要求高，影響因素多，本文將詳細說明制備方法。

通過不同方式制備腦缺血動物模型，達到腦部血流減少或中止的目的，常用方法可以分為血管阻斷法，如腦動脈的結扎、夾閉或熔斷等；血管堵塞法，如人工血栓法、自體血栓法、物理栓塞法、電凝法等。由于具體模型與研究內容有關，制備方法也有明顯不同，主要根據研究目的進行動物模型的設計，選擇適宜的模型制備方法。

2.1 全腦缺血全腦缺血可以分為急性全腦缺血和慢性全腦缺血(Tab 1)。

Tab 1 Methods and characteristics of wildly used animal models of cerebral ischemia

急性全腦缺血實驗動物模型主要有小鼠斷頭處死法，小鼠窒息致死法，大鼠窒息致死法等，還有二血管、三血管和四血管閉塞法，這些腦缺血實驗動物模型能夠模擬全腦急性腦缺血特點，但與臨床常見腦梗死(多為單一血管閉塞)病因和表現有較大差距，主要用于缺血病理機制研究和藥物作用研究。

慢性全腦缺血的實驗動物模型包括頸總動脈部分結扎制備的全腦低灌注模型，放血降低血容和灌注壓制備的全腦缺血模型等，在藥物作用機制研究方面有重要價值。

2.2 局灶性缺血局灶性腦缺血動物模型是與人類卒中的發生最為接近的實驗模型，包括永久性和短暫性兩種，后者模擬腦缺血/再灌注損傷。局灶性腦缺血模型常用于研究腦缺血損傷后的病理生理變化以及藥物作用機制，后文將全面介紹該模型。局灶性腦缺血動物模型主要包括開顱電凝法、光化學誘導法、微栓子阻斷法、電凝法、線栓法。

2.2.1開顱電凝法 1981年，Tamura和Bederson采用開顱法，手術暴露大腦中動脈并阻斷中動脈血流，在基底核和皮質區形成恒定梗死灶[12-13]。該模型是在可視條件下對大腦中動脈(MCA)進行閉塞，缺血效果可靠，可導致皮質與尾殼核同時栓塞。但開顱創傷大，操作技術要求高，且難以實現再灌注，應用較少。

2.2.2光化學和化學誘導法 Coyle在1982年及Waston在1985年均成功建立光化學法誘導腦皮質梗死動物模型[14-15]。光波照射光敏物質，在血管內引起光化學反應，導致內皮細胞損傷、血小板黏附聚集，進而形成血栓。該模型與臨床腦血栓形成過程具有相似性，但毛細血管損傷所形成的血栓和人類腦血栓的發生仍存在一定差異，且造成終末動脈永久性閉塞，無法實現再灌注，影響觀察擴血管藥療效。

2.2.3微栓子阻斷法 將同源血凝塊制備成微栓子懸液，經頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)進入MCA，致同側腦區梗死。該方法創傷小，且類似于人類血栓的形成過程。但由于血凝塊栓子具有一定隨機性，腦組織缺血程度不一，梗死部位及梗死體積無法預測[16-17]。

2.2.4自體血栓血管內形成法 分離大鼠CCA、ICA和頸外動脈(ECA)，同時夾閉ECA，電擊CCA形成血管內血栓。然后利用自身血流從頸總動脈將血栓沖入頸內動脈。該模型利用動物自身血液凝聚后形成的血栓造成局灶性腦缺血，更好地模擬了臨床上由于血小板聚集血栓形成阻斷腦血流導致腦缺血的發病過程，更適用于研究溶栓藥物和復雜機制治療局灶性腦缺血的藥物。動物死亡率和腦缺血損傷嚴重程度與電凝時間和血栓夾碎程度密切相關[18-19]。

2.2.5線栓法 Koizumi和Zea-Longa等[20-21]用頂端燙成球形的尼龍線經頸內動脈插入，成功制成大腦中動脈閉塞。該方法在不開顱的情況下，將尼龍線自頸外動脈導入直進至頸內動脈的顱內段MCA起始部，阻斷MCA血流，造成MCA供血區缺血，通過抽出尼龍線進行再灌注。MCA閉塞效果較理想，缺血與再灌注時間亦能準確控制。但是大鼠個體差異、線栓插入深度均會明顯影響模型的成功率。

2.3 多發性腦梗死和腔隙性腦梗死血管內栓塞的塞子可以是空氣、浮石、血凝塊、玻璃球、石蠟、鐵粉、絲線、硅橡膠、尼龍線等，目前常用血凝塊和石蠟栓塞等。取無菌且自然干燥的同種大鼠血凝塊研碎過篩，制成混懸液，推注栓子鹽水混懸液，造成多灶性腦梗死模型[22-23]。腔隙性腦梗死由腦部深穿動脈及其分支的特殊病變所致，Toshima等[24]通過在大鼠頸內動脈注入月桂酸鈉，制備腔隙性腦梗死模型。

3 腦缺血實驗動物模型的檢測指標和評價標準

實驗動物模型制備的目的是進行科學研究，選擇適當的檢測指標，可以評價實驗動物模型的病理狀態，能夠通過模型觀察藥物作用和治療效果。因此，選擇合適的檢測指標是實現實驗目的的關鍵。

3.1 自主運動行為評價采用計算機采集、記錄并分析動物自發活動，分析動物在各區域活動軌跡、路程、時間等，用于定量評價腦缺血后功能損傷。神經功能缺損評分，目前普遍使用的主要是Zea-Longa評分法和Bederson分級法[13，20]。

3.2 運動協調能力評價轉棒實驗，最早由Dunham和Miya建立[25]。用動物在轉棒上停留的時間，衡量其運動功能，評估平衡和協調能力。平衡木實驗，Feeney等[26]將走橫木實驗作為判斷腦缺血動物運動整合性和協調性的指標。伸爪試驗，1986年Whishaw等[27]建立評價大鼠肢體運動功能的方法，通過分析動物攝食過程，辨別肢體損傷與修復的差別。圓筒實驗，將動物置于透明圓筒中記錄其活動，通過對探索過程中受重情況的分析評價前肢不對稱性[28]。

3.3 學習記憶功能評價中樞神經系統的海馬神經元對缺血缺氧損傷較敏感，且與學習記憶功能密切相關，人類腦卒中導致的海馬神經元損傷會伴隨著認知與記憶功能障礙，在腦缺血動物模型中也需要考察動物的認知、記憶功能。

Morris水迷宮實驗，經過訓練后的動物，利用空間記憶和視覺線索尋找水下平臺，全程記錄并分析動物到達平臺的時間、軌跡和路程。旋臂迷宮實驗，動物依靠其空間感，以期耗費最少精力，使用最短時間，最大限度獲得食物與水。被動和主動回避實驗，根據動物進入暗室錯誤次數和避暗潛伏期，判斷其學習記憶能力。

缺血性腦損傷通常與運動、感覺和認知功能障礙有關，單一行為學測試不能充分反映神經功能，常采用多種行為學測試，綜合評估動物的感覺運動功能、認知和探索行為。

3.4 腦組織形態和功能的檢測腦梗死體積測定，腦梗死體積是反映抗腦缺血損傷藥物藥效最直接的指標，梗死體積的大小，代表缺血的嚴重程度。病理檢測常用蘇木精-伊紅染色法全面觀察正常和病變組織的形態結構。腦水腫百分比測定，評價腦缺血損傷后膠原組織的水腫程度。腦電圖分析，反映MCA供血區和非供血區的腦電圖變化，評估腦缺血的范圍和腦梗死的程度。局部腦血流量測定，測定MCA供血中心區缺血后各時間點腦血流變化。軟腦膜微循環觀察，通過測量微血管的管徑及血流速度，考察軟腦膜微循環血液的灌流狀況。

3.5 其他檢測指標根據模型特點和研究目的，設計合適的檢測指標，包括生理指標、病理指標、組織形態、分子生物學變化等。不同模型的特點及適宜的檢測指標見Tab 2。

4 局灶性腦缺血的評價標準和用途

4.1 常用制備方法2015年，本實驗室報道了自體血栓中動脈阻塞法，仰臥位固定大鼠，鈍性分離血管組織和血管，分離CCA并置入血栓生成儀的血管電擊夾溝槽中，電流強度為1.00 mA，持續刺激225 s后將所形成的血栓用鈍性且表面光滑的鑷子夾碎后，利用自身血流，將血栓從CCA沖入ICA，沖入后立即用動脈夾夾閉頸總動脈近心端15 min，然后打開所有動脈夾，恢復血流。利用動物自身血液凝聚后形成的血栓造成局灶性腦缺血，更好地模擬了臨床上由于血小板聚集血栓形成阻斷腦血流導致腦缺血的發病過程[18-19]。

線栓法，用頂端燙成球形的尼龍線經ICA插入，制成MCA閉塞。仰臥位固定大鼠，頸正中線切口約2 cm，鈍性分離組織與血管，將尼龍線由ECA插入后導入ICA，松開ICA夾，繼續將尼龍線插入至其顱內段，自CCA分叉處插入的尼龍線長約20 mm，阻斷MCA。再灌注時將線栓抽出，結扎ECA殘端，松開CCA。本方法在不開顱的情況下，將尼龍線自ECA導入進至ICA的顱內段MCA起始處，阻斷MCA血流，造成MCA供血區缺血，通過抽出尼龍線實現再灌注。

4.2 模型評價標準

4.2.1神經功能缺損評分 神經行為學評價反映了模型病理生理發生發展的過程。腦缺血損傷發生后缺血半暗帶的病理發展在有限時間內是可逆的，隨缺血時間延長，缺血中心區擴大到半暗帶，病理損傷不可逆發展。目前，應用最普遍的神經癥狀評分方法是Zea-Longa評分法和Bederson分級法[13，20]。

對模型動物進行神經功能缺損評分，排除無癥狀及不能自發行走的動物后，隨機分組，進行后續實驗。然而，Zausinger等[29]發現，大鼠腦缺血90 min后再灌注，48 h皮層梗死體積與分級評分存在相關性，72 h全腦梗死體積與分級評分存在相關性。因此，現有的神經行為學評分尚不能全面反映腦缺血的生理病理狀態，不同種屬大鼠在相同損傷程度下其神經行為學評價也可能存在差異。

一般在線栓法制備局灶性腦缺血模型中，模型組大鼠神經行為學評分顯著升高，實驗時應選取Longa評分達到2分或3分的動物參加實驗，剔除意識不清與無癥狀動物，以保證實驗結果的穩定性。

4.2.2腦梗死體積 腦梗死體積是反映抗腦缺血損傷藥物藥效最直接的指標，梗死體積的大小，代表缺血嚴重程度。在線栓法制備局灶性腦缺血模型中，模型組大鼠腦梗死體積顯著升高，缺血90 min再灌注24 h大鼠缺血腦半球出現梗死，梗死體積由27.39%變化到45.09%，低于20%說明模型可能沒有成功，Fig 1。

Fig 1 Cerebral infarct after ischemia 90 min/reperfusion 24 h

經過對近年來發表的帶有TTC染色的92篇文章的統計分析發現，文獻中腦梗死體積差異很大。缺血/再灌注時間主要集中于缺血60、90、120 min，再灌注24 h,Fig 2。

采用相同的實驗方法，得到梗死體積最高達73%，最低為19%。實驗過程中許多因素直接影響著實驗研究的結果，包括大鼠個體差異、線栓插入深度均會明顯影響模型的成功率及梗死體積。除此之外，所用統計方法、切片厚度與統計片數、計算公式、是否校正水腫等均可能對實驗結果造成影響，甚至導致偏差。

在我們所統計的92篇文章中，所使用的統計軟件主要包括：Image-Pro Plus 6.0，ImageJ，Motic Med 6.0，NIH Image Analyzer，AutoCAD，PhotoShop CS4，Motic Med 6.0。文章展示的切片數從1～8片不等。所使用的計算方法包括：① 梗死體積/同側半球總體積。② 梗死體積/對側半球總體積。③ 梗死體積/全腦總體積。④ [對側半球總體積-(同側半球總體積-梗死體積)]/對側半球總體積。⑤ [梗死體積-(同側半球總體積-對側半球總體積)]/對側半球總體積。⑥ 測量的梗塞面積×(1-[(同側半球面積-對側半球面積)/對側半球面積])。⑦ E=(ΣVR-ΣVL)/(ΣVL+ΣVR)×100%計算水腫率(E)。ΣVR和ΣVL分別是右側(缺血)和左側(非缺血)半球的體積。使用以下等式計算背景：B=ΣVS/ΣVT×100%，其中ΣVS是假手術組中未染色的白質的體積，ΣVT是總腦容量。考慮到水腫和背景的影響，使用以下等式間接確定梗塞體積并表示為整個腦的百分比：I=[ΣVI×(1-E)/ΣVT×(1-B)]×100%，其中ΣVI是未用TTC染色的組織的體積，Fig 3。

Fig 2 Infarct volume distribution for ischemia 60，90，120 min/reperfusion 24 h

Fig 3 Cerebral blood flow changes

4.2.3腦水腫百分比 每只動物的大腦在切片前稱取濕重，染色后收集切片，于95 ℃干燥24 h至恒重，稱取每只動物大腦干重，比較各組動物的腦含水量。在線栓法制備局灶性腦缺血模型中，模型組大鼠腦含水量升高，缺血90 min再灌注24 h缺血半球水腫程度增加21.6%到30.4%。

5.2.4測定大腦皮質局部腦血流量(rCBF) 研究表明腦血流量隨缺血時間進行性降低，各時間點差異有顯著性，回歸分析示rCBF與時間呈負相關。在線栓法制備局灶性腦缺血模型中，插入線栓后腦血流顯著降低，與自身術前腦血流相比，降低60%到80%則認為模型成功。

5 總結

近幾十年來，國內外學者對腦缺血模型從動物的選擇、模型的分類及方法制備等方面進行有益探索和不斷完善，明顯提高了模型的成功率和腦梗死灶的穩定性，使得腦缺血模型制備日趨完善。在今后的研究中，不僅應重視缺血損傷的可控性和重復性，嚴格控制各種干擾因素，減少其對實驗結果的影響，還應從實驗動物、模型選擇、實驗條件、實驗流程、評價指標與測試等方面構建一系列統一的標準體系，使得實驗方法和實驗流程等方面進一步科學化、標準化、規范化。

模擬人類腦血管疾病的發病進程，建立穩定易重復，生理指標嚴格可控的動物模型，對腦血管病的研究具有重要意義，恰當的評價指標是研究過程的重要環節。目前仍存在一些問題：①對實驗性腦缺血不同階段未進行深入研究，缺血后不同階段，由于損傷可逆、自我修復以及正常代償的存在，如果采用較單一的神經行為學缺損評分進行評價，容易誤導實驗結果的產生。因此，腦缺血不同時間點應分別采用何種評價方式是亟須解決的問題。②感覺運動評估方式對實驗員的主觀能動性，動物自身的飲食和活潑度均有一定的要求。因此，如何更客觀、量化且操作性及重復性強的進行評估，同樣有待解決。

腦缺血損傷后的評價體系正在逐步成熟，不同的評價方法以不同程度和形式考察大鼠腦缺血后多種類型的行為改變，將行為學評分、學習記憶與腦梗死體積、病理學檢測進行有效、合理地組合，不僅利于實驗者的分析比較，更易于展現治療因素的優勢。建立標準化、規范化的動物模型，以及信度、效度、反應度和可行性較好的評價指標令人期待。