機械敏感性離子通道Piezo1介導高靜水壓誘導大鼠冠脈平滑肌細胞表型改變

李穗敏，秦曉玥，曾 鵬，陳淑貞，鄺素娟，楊 慧，饒 芳，鄧春玉，3

(1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006，2.廣東省人民醫院、廣東省醫學科學院醫學研究部臨床藥理重點實驗室，廣東 廣州 510080；3.華南理工大學醫學院，廣東 廣州 510006)

高血壓是一種以體循環血壓升高為特征的慢性疾病，可導致心、腦、腎等器官發生器質性病變，誘發冠心病、腦卒中、慢性腎衰竭等疾病，是全球心血管疾病的主要誘因，也是死亡的主要原因[1]。對2012-2015年間中國高血壓狀況調查發現，我國成年人患病率高達27.9%，且呈逐年上升的趨勢，僅2017年內就有約243萬人死于因高收縮壓引起的心血管疾病[2]。

血管可分為內膜、中膜以及外膜三層結構，血管的病理性改變主要涉及內膜的內皮細胞受損，中膜的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)由收縮表型向合成表型轉變，外膜纖維化，而VSMCs表型改變時產生的收縮蛋白斷裂、表達減少以及細胞外基質的改變是導致血管重構以及收縮功能障礙的主要原因之一[3]。既往研究表明，主動脈平滑肌細胞的收縮反應主要由L型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC/Cav1.2)介導，而從自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)分離的冠脈平滑肌細胞中，Cav1.2表達低于Wistar大鼠[4]。在生理條件下，VSMCs為高度分化的收縮表型并大量表達可執行收縮功能的收縮蛋白，包括α-肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重鏈(smooth muscle myosin heavy chain，SM-MHC)，而當受到不良因素刺激則會轉化為分化程度較低的合成表型，其合成與分泌功能增強，能大量合成骨橋蛋白(osteopntin，OPN)、膠原蛋白(collagen)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)等并分泌至胞外，參與細胞外基質(extracellular Matrix，ECM)重塑[5-6]。機械敏感性離子通道Piezo1是一種38次跨膜的非選擇性陽離子通道，但對鈣離子具有輕微選擇性，可被剪切力、牽張力、靜水壓力等多種機械力激活，并將機械信號轉化為細胞內生化信號，參與細胞的分化、增殖、遷移等生物過程[7]?，F有研究表明[8]，Piezo1可促進高血壓小鼠尾動脈的重構；從特發性肺動脈高壓患者中分離的肺動脈平滑肌細胞的增殖及收縮能力增加與Piezo1的表達量及活性上升有關[9]。盡管近年來研究發現Piezo1與多種血管病變相關，但Piezo1在高壓負荷下誘導的冠狀動脈平滑肌細胞(coronary arterial smooth muscle cells，CASMCs)表型改變的作用尚不清楚。因此，本研究通過高靜水壓誘導原代Wistar大鼠CASMCs為模型，以Piezo1為切入點，探究Piezo1是否與高壓負荷下CASMCs 由收縮表型向合成表型轉化相關，擬為高血壓相關的冠心病提供新的治療靶點。

1 材料

1.1 實驗動物SPF級，雄性Wistar大鼠，體質量為(220～250) g，共10只，購于南方醫科大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(粵)2016-0041。本研究所有動物實驗已通過廣東省人民醫院(廣東省醫學科學院) 的動物實驗倫理審查(No CDREC201208A)。

1.2 主要試劑與儀器XTL250型體視顯微鏡(上海光密儀器有限公司)；蛋白電泳儀、轉膜儀(北京市六一儀器廠)；Leica SP5-FCS激光共聚焦顯微鏡(德國)；DMEM 培養基(C11885500BT)、澳洲胎牛血清(FBS)、0.25% EDTA-胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素(Gibco)；抗Piezo1(APC-087)抗體、抗Cav1.2(ACC-003)抗體(Alomone)；抗 α-肌動蛋白抗體、抗I型膠原蛋白α1鏈抗體(abcam)；抗基質金屬蛋白酶-2抗體(Millipore);抗骨橋蛋白抗體(Bioworld Technology)；抗平滑肌肌球蛋白重鏈抗體、抗GAPDH(60004-1-Ig)抗體(Proteintech)；Yoda1(HY-18723)、GsMTx4(HY-P1410A)(MedChemExpress)；Lipofectamine 3000轉染試劑(Invitrogen)；Piezo1小干擾RNA(siRNA-Piezo1；銳博生物)；磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS；武漢博士德公司)；其余試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 原代大鼠冠脈平滑肌細胞(CASMCs)的獲取及培養冠狀動脈分離方法參照已發表的文獻處理[10]。Wistar大鼠吸入CO2麻醉后脫臼處死，皮膚經75%乙醇棉球消毒后迅速打開胸腔，取出心臟，放入經4 ℃預冷的無菌PBS溶液(含1%雙抗)中，于超凈臺內，體視顯微鏡下分離出大鼠心臟的左前降支、右冠脈及間隔支，小心去除冠脈周圍的心肌組織，將冠脈剪碎成長度為0.5 mm左右的小段，滴2滴20% FBS的DMEM培養基(含1%雙抗)，用無菌巴氏管混合均勻并均勻平鋪于25 cm2培養瓶的培養面上，輕輕翻轉培養瓶，使培養面朝上，加入5 mL的20% FBS的DMEM培養基(含1%雙抗)，于培養箱(37 ℃，5% CO2)中靜置約1.5 h，待組織塊貼牢后，輕輕翻轉培養瓶，培養面朝下，培養基浸沒過所有組織塊，繼續培養。每隔4 d換液，待細胞從組織塊邊緣爬出并生長至融合成片達80%后，用0.25%胰酶進行消化傳代，P2-P4代細胞用于實驗。

2.2 CASMCs的干預及分組

2.2.1壓力模型的構建 待CASMCs密度生長至約60%時，將細胞放置于自行研制的高壓裝置中(專利號201420109263. 1，中國)，該裝置內部可穩定維持一定壓力。根據正常成年雄性大鼠的收縮壓約為100～120 mmHg，高血壓大鼠收縮壓約為180～200 mmHg，以0 mmHg為對照，分別在0、120、180 mmHg壓力下干預CASMCs 24 h。

2.2.2Piezo1參與CASMCs的表型改變 ① Yoda1干預，使用Piezo1特異性激動劑Yoda1在0 mmHg下濃度梯度干預CASMCs 48 h，實驗分組依次為：對照組(Control)，DMSO組，Yoda1組(終濃度分別為：1、3、10 μmol·L-1)；②GsMTx4干預，使用不同濃度Piezo1抑制劑GsMTx4預處理CASMCs 2 h，再于180 mmHg下繼續干預24 h，實驗分組為對照組(Control)，GsMTx4組(終濃度分別為：0.3、1、3 μmol·L-1)。

2.2.3原代CASMCs的siRNA轉染 使用Lipofectamine 3000 試劑進行轉染，分別設置對照組(Control)、陰性對照組(NC)和siPiezo1組，于125 μL Opti-MEM培養基中加入100 μmol的siRNA，再加入等體積的含5 μL Lipofectamine 3000的Opti-MEM培養基，混合均勻，靜置15～20 min，加入CASMCs中轉染24 h后，于180 mmHg壓力下繼續轉染24 h。

2.3 CASMCs細胞內鈣離子水平的檢測將CASMCs種于激光共聚焦皿中，按“2.2.3”的方法對細胞進行干預后，在避光條件下加入3 μmol·L-1的Fluo-4AM熒光探針，37 ℃孵育30 min，用PBS洗3次，每皿加入1 mL的2 mmol·L-1含鈣臺式液，激光共聚焦顯微鏡下掃描6 min，于1 min時加入終濃度為10 μmol·L-1的Yoda1，記錄空白背景熒光值F0、細胞基礎熒光值F1以及峰值F2，計算方式以(F2-F1)/(F1-F0)表示。

2.4 Western blot處理后的細胞用PBS洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA于冰上裂解30 min，刮下細胞并收集裂解液，12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液為總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液(4× loading buffer)和RIPA，使每組蛋白為等體積等質量上樣，變性后依次進行SDS-PAGE電泳、轉膜、脫脂牛奶封閉、一抗4 ℃孵育過夜、二抗室溫孵育1 h，采用ECL法于化學發光成像儀內顯影條帶，最后通過ImageJ軟件計算條帶灰度值及與內參GAPDH的灰度比值。

3 結果

3.1 高靜水壓負荷促進CASMCs由收縮表型向合成表型轉化將CASMCs分別置于0、120、180 mmHg條件下培養24 h，Western blot檢測不同壓力干預后對CASMCs收縮表型標志物Cav1.2、SM-MHC、α-SMA以及合成表型標志物OPN、MMP-2、Col1a1的表達變化。結果如Fig 1所示：與0 mmHg組相比，Cav1.2、SM-MHC以及α-SMA的蛋白表達水平均隨壓力增大而梯度降低，并在180 mmHg壓力下達到最大差異(P<0.01)，相反，MMP-2、Col1a1和OPN的表達水平則隨壓力增大而梯度升高，在180 mmHg壓力下達到最高水平(P<0.05)。以上結果提示，高靜水壓可以促進CASMCs由收縮表型向合成表型轉化。

3.2 高靜水壓誘導CASMCs中Piezo1的表達水平升高及其介導的Ca2+內流增強結果如Fig 2所示：與0 mmHg組相比，Piezo1的表達水平在120和180 mmHg組均有所升高，且與壓力大小呈正相關，并在180 mmHg組達到最大值(P<0.05)。激光共聚焦測鈣結果顯示，加入Yoda1激活Piezo1后，180 mmHg-NC組的熒光升高比值高于0 mmHg-NC組(P<0.01)，但使用siRNA敲低Piezo1后，細胞熒光上升比值明顯低于180 mmHg-NC組(P<0.01)。以上結果說明，高靜水壓可誘導Piezo1的表達水平以及其通道活性升高。

3.3 Yoda1特異性激活Piezo1促進CASMCs向合成表型轉化為了進一步探究Piezo1與CASMCs表型改變的關系，在0 mmHg非高壓狀態下，使用不同濃度的Piezo1特異性激動劑Yoda1干預CAMSCs，結果如Fig 3所示：與DMSO組相比，收縮表型標志物SM-MHC、α-SMA的表達水平隨Yoda1的濃度升高而降低，在10 μmol·L-1組達到最小值(P<0.01)，Cav1.2也在10 μmol·L-1組下降至最低(P<0.05)，而合成表型標志物MMP-2、Col1a1表達水平隨Yoda1的濃度升高而升高，并在10 μmol·L-1組達到最高值(P<0.05)，OPN表達水平也達最大值(P<0.01)。以上結果提示，激活Piezo1可誘導CASMCs由收縮表型向合成表型改變。

Fig 1 Effect of high hydrostatic pressure on expression of contractile phenotype and synthetic phenotype-related

3.4 GsMTx4抑制Piezo1可減輕高靜水壓誘導的CASMCs表型改變在180 mmHg高壓條件下，使用Piezo1抑制劑GsMTx4濃度梯度干預CASMCs 24 h，結果如Fig 4所示：與對照組相比，收縮表型標志物SM-MHC和α-SMA的表達水平隨GsMTx4的濃度升高而升高，在3 μmol·L-1組達到最大值(P<0.01)，Cav1.2也在3 μmol·L-1組上升至最高(P<0.05)，而合成表型標志物OPN、Col1a1的表達水平隨GsMTx4的濃度升高而下降，并在3 μmol·L-1組達到最低值(P<0.01)，此時MMP-2表達水平也最低(P<0.05)。以上結果表明，抑制Piezo1的活性可減緩高靜水壓所致的CASMCs表型改變。

Fig 2 Effect of high hydrostatic pressure on expression of Piezo1 and calcium influx mediated by Piezo1 in CASMCs

Fig 4 Effect of GsMTx4 on expression of contractile phenotype and synthetic phenotype-related proteins in CASMCs under high

3.5 敲低Piezo1可減輕高靜水壓誘導的CASMCs表型改變結果如Fig 5所示：與陰性對照組相比，敲低Piezo1后，收縮表型標志物SM-MHC和α-SMA表達水平升高(P<0.05)，而合成表型標志物OPN和MMP-2有所降低(P<0.05)。與使用抑制劑GsMTx4干預的實驗結果一致，敲低Piezo1可以減少高靜水壓誘導的CASMCs表型改變。

Fig 5 Expression of contractile phenotype and synthetic phenotype-related proteins in CASMCs after knockdown Piezo1 under high

4 討論

以上研究結果表明，高壓負荷可上調并激活CASMCs的Piezo1，并下調收縮表型相關蛋白Cav1.2、SM-MHC、α-SMA，同時上調合成表型相關蛋白OPN、MMP-2、Col1a1，表明高壓負荷下CASMCs由收縮表型向合成表型轉變，給予Piezo1激動劑Yoda1干預CASMCs 48 h后，收縮表型相關蛋白表達下降而合成表型相關蛋白表達升高，結果與高壓干預的細胞模型實驗結果一致。為進一步證實Piezo1與高壓負荷CASMCs表型改變之間的關系，在180 mmHg高壓培養條件下，分別使用Piezo1抑制劑GsMTx4和siRNA-Piezo1干預CASMCs后，收縮表型相關蛋白表達上升，合成表型相關蛋白表達有所下調，表明抑制或者敲低Piezo1可緩解高壓負荷導致的CASMCs表型改變，提示高靜水壓可通過激活Piezo1導致CASMCs由收縮表型向合成表型轉變。

高血壓是誘發冠狀動脈疾病的主要獨立危險因素，流行病學調查顯示，收縮壓每增加20 mmHg或舒張壓每增加10 mmHg，發生致命冠狀動脈疾病的風險就會增加1倍[11]。另有研究證明，從SHR大鼠分離的冠狀動脈對高濃度的血管收縮劑5-羥色胺(5-HT)以及血栓素類似物U46619的收縮反應均低于Wistar大鼠[4]，提示高血壓會導致冠脈功能障礙，但其具體分子機制仍未清楚。

血管主要受到剪切力、牽張力以及靜水壓力這3種機械力刺激，而血流剪切力主要由血管內皮細胞感知，平滑肌細胞則更多的受血管收縮及舒張產生的牽張力和管腔內血流對血管壁產生的靜水壓力影響，而這些外界的機械信號需要通過細胞膜上的某些特定機械敏感通道(包括Piezo1、瞬時受體電位transient receptor potential，TRP通道)和細胞骨架轉換成細胞內生物信號才能影響細胞的狀態和功能[12]，但是，有研究發現，來源于平滑肌特異性敲除Piezo1的小鼠小動脈則完全失去機械激活的離子通道活性，而且，只要持續激活Piezo1也可以使血壓正常的小鼠發生血管重塑[8]。因此，我們認為，Piezo1在高血壓導致的冠脈重構中起關鍵作用。然而，血管重塑的主要原因之一是VSMCs由收縮表型向合成表型轉變，VSMCs分泌物如OPN、MMPs、膠原合成增多并分泌至胞外，參與細胞外基質重塑[5，13]。研究證實，自發性高血壓大鼠和由血管緊張素II誘導的高血壓小鼠的主動脈組織以及血漿的OPN和MMP-2水平升高[14]，與WKY相比，SHR來源的主動脈VSMCs的OPN表達水平升高，而α-SMA表達降低[15]。因此，我們采用壓力裝置給CASMCs施加不同的靜水壓力以模擬高血壓大鼠的血壓，通過壓力干預后發現，Piezo1表達上升，合成表型標志物OPN等表達增加，而收縮表型標志物α-SMA等表達減少。由于Piezo1對鈣離子具有一定的選擇性，且其介導的鈣離子內流強度與施加的剪切力大小或其激動劑Yoda1的濃度呈正相關[16]，為了驗證高壓干預CASMCs后，Piezo1不僅表達水平升高，而且其功能也有所提高，我們利用Fluo-4熒光法檢測了180 mmHg高壓干預后CASMCs對10 μmol·L-1Yoda1刺激下引起的鈣離子內流程度，結果發現，高壓干預后的CASMCs對Yoda1引起的鈣離子內流明顯高于常壓組。且隨Piezo1的敲低而減弱，證明高靜水壓可激活Piezo1。為進一步證實Piezo1與CASMCs表型改變的相關性，我們使用Yoda1在0 mmHg常壓下持續性激活Piezo1，已有研究表明，Yoda1激活Piezo1可通過激活MT1-MMP-2信號通路促進血管生成[17]，而本研究發現，Yoda1干預CASMCs后，MMP-2等合成表型標志物表達升高，而收縮表型標志物表達減少，且具有濃度依賴性，提示在沒有高壓情況下，激活Piezo1也可促進CASMCs由收縮表型向合成表型轉變，結果與高壓干預的實驗結果一致，而這種改變可被Piezo1抑制劑GsMTx4或敲低Piezo1所逆轉，說明高靜水壓可通過激活Piezo1，進而促進CASMCs由收縮表型向合成表型轉變，但Piezo1調控CASMCs表型的具體機制仍有待研究。

綜上所述，本研究已初步證實高靜水壓通過上調并激活Piezo1促進CASMCs由收縮表型向合成表型轉變，為治療和預防高血壓所致的冠心病提供新的理論依據。