基于網絡藥理學和分子對接技術探討活血解毒中藥配伍抗動脈粥樣硬化作用機制

崔 京，李逸雯，羅斌玉，朱夢夢，陳可冀，劉 玥

(國家中醫心血管病臨床醫學研究中心，中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091)

動脈粥樣硬化性心血管疾病目前仍然嚴重威脅人類健康，已成為國人的重要死因之一[1]。陳可冀院士帶領研究團隊基于中醫“血瘀”理論，結合多年臨床實踐經驗，采用循證醫學的方法證實了活血化瘀法治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的顯著療效，并結合急性心血管事件的發生特點和動脈粥樣硬化易損斑塊的病理生理特點創新性提出“瘀毒致易損斑塊”的理論[2]及活血解毒治法的臨床應用優勢，為拓展血瘀證及活血化瘀研究領域奠定了理論與實踐支撐。

當歸-金銀花作為清熱解毒與散瘀養血兼顧的配伍，在清熱活血解毒歷代名方中均有廣泛應用，如四妙勇安湯、仙方活命飲、托里消毒散等，現今仍被廣泛應用于“異病同治”多種證屬熱毒血瘀范疇的疾病，其中四妙勇安湯在動脈粥樣硬化性心血管疾病，尤其是辨證屬“瘀毒互結”的治療中的探究較為全面[3]。現代藥理研究發現，金銀花在體外具有抗炎、抗血小板聚集的作用[4]，當歸可以改善冠脈循環，保護心肌細胞，其有效成分阿魏酸鈉同樣被證實在抗血小板聚集方面療效確切[5]。

本文運用網絡藥理學方法[6]對當歸-金銀花配伍有效活性成分和動脈粥樣硬化疾病相關靶點進行篩選及預測分析，并用分子對接技術驗證篩選出的活性物質與作用靶點的結合情況，為當歸-金銀花配伍和AS的后續研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 “當歸-金銀花”藥物成分及潛在作用靶點篩選以當歸、金銀花為關鍵詞檢索TCMSP數據庫(https：//tcmspw.com/tcmsp.php)，根據口服生物利用度OB≥30%、藥物相似性DL≥0.18兩個參數對藥物成分進行篩選，獲得活性成分及作用的蛋白質靶點，并根據已發表的文獻對未預測到及口服利用度低但具有良好治療作用的成分及靶點進行補充。利用Uniprot蛋白質數據庫對當歸-金銀花活性成分對應的靶點進行基因標準化處理，限定物種為“Homo Sapiens”。

1.2 動脈粥樣硬化相關靶點篩選以“atherosclerosis”為關鍵詞檢索Gene Cards數據庫獲取動脈粥樣硬化的相關靶點基因，并通過OMIM數據庫及Drugbank數據庫進行補充。合并3個數據庫基因靶點并刪除重復值，最終獲得對動脈粥樣硬化相關靶點。

1.3 “當歸-金銀花”與動脈粥樣硬化靶點蛋白相互作用網絡構建根據已獲取的藥物和疾病相關靶點，利用Venny 2.1將當歸-金銀花作用靶點與動脈粥樣硬化靶點取交集并繪制韋恩圖，得到共同靶點。將共同靶點導入String 11.0數據庫，生物種類設為“Homo sapiens”，最小相互作用評分設定為>0.9，其余設置默認并對游離節點進行隱藏，構建靶點蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)網絡。

1.4 基因本體(Gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析利用Metascape平臺對當歸-金銀花抗動脈粥樣硬化的靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，物種選擇“H.sapiens”，選取P<0.01的GO生物學過程和KEGG通路，通過Omicshare和Bioinformatics平臺實現可視化。

1.5 “藥物核心成分-靶點-通路”網絡構建將已獲得的當歸-金銀花藥物活性成分、作用靶點、相關通路整理后導入Cytoscape 3.8.2軟件，利用內置分析工具進行分析其網絡拓撲參數，選取度值前10位的有效成分、作用靶點及度值前20位的通路建立“藥物核心成分-靶點-通路”網絡圖。

1.6 分子對接驗證分別選取Cytoscape 3.8.2軟件分析結果中度值前10位的有效成分與潛在作用靶點，在PubChem和RCSB PDB平臺獲取小分子配體和蛋白受體，以分辨率高和參考文獻支持為篩選條件。通過ChemOffice對小分子配體進行能量最小化處理，PyMOL軟件對蛋白配體移除水分子、小分子配體，AutoDockTools加氫、計算電荷并設置為剛性分子。最后選中所有活性位點，通過AutoDockTools設置對接盒子進行分子對接，OpenBabel軟件與PLIP平臺確定結合位點并進行可視化處理。

2 結果

2.1 “當歸-金銀花”活性化合物篩選及活性成分-靶點網絡構建在TCMSP數據庫中按OB值和DL值進行篩選及閱讀文獻補充[7]，共得到當歸-金銀花藥對活性成分31種，其中當歸有效成分11種、金銀花23種，共同成分3種(Tab 1)，靶點509個。將數據導入Cytoscape 3.8.2軟件，得到“活性成分-靶點”網絡圖(Fig 1)，分別用不同形狀、顏色代表中藥成分及靶點基因。Fig 1共包含542個節點，820條邊，運用軟件中Analyse Network計算，按度值大小順序排列節點。

Fig 1 Chinese medicine herb-compound-target network of angelica sinensis-lonicerae japonicae flos

Tab 1 Characteristic parameters of network nodes of main active components of angelica

2.2 動脈粥樣硬化潛在靶點收集通過Gene Cards數據庫得到動脈粥樣硬化相關靶點4623個，按Relevance Score值從高到低排序，取前1/2的目標靶點，即Relevance Score>1為動脈粥樣硬化潛在靶點，再結合OMIM、Drugbank數據庫補充相關靶點，刪除重復值，最終得到2118個動脈粥樣硬化相關靶點。

2.3 關鍵作用靶點篩選與靶點蛋白互作網絡構建及拓撲分析通過Venny 2.1將當歸-金銀花活性成分靶點與動脈粥樣硬化靶點取交集，并繪制韋恩圖(Fig 2)，得到共同靶點210個，約占靶點總數的8%。將共同靶點上傳至String 11.0平臺構建PPI網絡，設置置信度>0.900，“Network Type”選擇“physical network”，清除游離節點，共形成248個節點，1 266條邊，節點代表作用靶點，“邊”代表作用靶點之間的關聯(Fig 3)。

Fig 2 Ingredients of angelica sinensis-lonicerae japonicae

將PPI網絡導入Cytoscape3.8.2，利用Analyse Network進行計算，得到平均節點度值約為11.25，平均介度約為0.008 96，平均緊密度約為0.367，按≥2倍平均值的節點度值和介度、大于平均值的緊密度值篩選得到20個靶點，認為是當歸-金銀花配伍發揮抗動脈粥樣硬化的關鍵靶點(Tab 2)。

Tab 2 Characteristic parameters of network nodes of main target gene

2.4 GO功能與KEGG通路的富集分析運用metascape平臺對篩選到的靶點進行GO注釋分析，共有條目3 354個，GO-BP生物過程(biological process，BP)2 961個，GO-CC細胞組成(cellular component，CC)151個，GO-MF分子功能(molecular function，MF)242個，篩選排名前10的功能(Fig 4)。

Fig 3 PPI network of angelica sinensis-lonicerae japonicae flos atherosclerosis target

Fig 4 GO enrichment analysis of potential targets of main components in angelica sinensis-lonicerae japonicae flos

結果可見生物過程涉及應對受傷、細胞對氮化合物的反應、創傷修復、細胞死亡的積極調控、脂多糖的應答等；細胞組成主要涉及膜筏、樹突、樹突樹、胞質囊腔、分泌顆粒內腔、細胞外基質、胞質核周區域等；分子功能主要體現在肽酶活力、作用于l -氨基酸肽、絲氨酸水解酶活性、酪氨酸激酶結合蛋白、絲氨酸蛋白酶內肽酶活力、絲氨酸蛋白酶肽酶活力。

KEGG通路富集結果顯示，潛在的當歸-金銀花協同抗動脈粥樣硬化治療靶點富集在250條通路上，選取排名前20通路，運用omicshare平臺(https：//www.omicshare.com/)繪制氣泡圖行可視化分析(Fig 5)。氣泡大小表示基因數目，顏色差異代表基因富集的顯著性大小。可以看出與當歸-金銀花抗動脈粥樣硬化相關的排名靠前的關鍵通路有磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路(靶標數43)、腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)信號通路(靶標數37)、流體剪切應力和動脈粥樣硬化(靶標數36)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(靶標數35)、IL-17信號通路(靶標數29)、細胞衰老(靶標數28)、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路(靶標數28)、細胞凋亡(靶標數28)等，提示當歸-金銀花配伍的活性成分主要是通過這些通路在抗動脈粥樣硬化過程中發揮作用的。

Fig 5 Bubble diagram of analysis of KEGG

2.5 當歸-金銀花活性成分-疾病靶點-通路網絡圖構建采用Cytoscape 3.8.2軟件對篩選出的活性成分、疾病靶點及通路進行可視化分析(Fig 6)。列出度值前10位的活性成分，見Tab 3。隨著技術發展，篩選藥物靶標的方法也逐漸多樣，多種方法相結合可以相互佐證，提高篩選效率與準確性。L-色氨酸(L-Tryptophane，50)、槲皮素(quercetin，39)、木犀草素(luteolin，31)、山奈酚(kaempferol， 25)、阿魏酸(ferulic acid，23)、β-胡蘿卜素(beta-carotene，21)、beta-谷甾醇(beta-sitosterol，20)、3-丁基-1(3H)-異苯并呋喃酮(3-Butylphthalide，14)、咖啡酸(caffeic acid，14)、蘆丁(rutin，14)是當歸-金銀花配伍發揮作用的主要活性成分，前文PPI預測結果中前20位中有MAPK1、MAPK3、AKT1等3個靶點仍排在通路富集靶點的前10位中[8]，因此可能是發揮作用的主要靶點。

Tab 4 Characteristic parameters of network nodes of 10 potential targets

Fig 6 Network of compound-pathway-target

Tab 3 Characteristic parameters of network nodes of 20 main active components of angelica sinensis-lonicerae japonicae flos

2.6 分子對接驗證根據之前分析結果，取當歸-金銀花度值前10位有效成分與潛在作用靶點前10位，利用AutoDock軟件進行分子對接，運用PyMOL軟件進行可視化呈現(Fig 7、8)。結果顯示，山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、蘆丁(rutin)、beta-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)是與疾病靶點結合較好的活性成分；MAPK3、AKT1、PRCKB是有效成分作用較好的疾病靶點。小分子配體與蛋白受體結合能越低，結合分子之間越穩定，提示分子之間發生相互作用的可能性越大，Fig 8中展示了其中對接結果較好的4組。

3 討論

一直以來，AS與冠心病及急性冠脈綜合征等嚴重心血管不良事件的發生密不可分，脂蛋白代謝紊亂和炎癥是一直是受到廣泛關注的經典理論。當歸-金銀花是在臨床應用中使用頻率較高的活血解毒中藥配伍，且已有實驗證實，在BV-2小膠質細胞中，金銀花的活性成分能夠抑制脂多糖刺激的一氧化氮(NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2)的產生，顯著抑制p38 絲裂原活化蛋白激酶(mito-genactivated protein kinase，p38 MAPK)和PI3K-Akt，從而發揮抗炎的作用[9]；當歸可以通過降低大鼠血清中NO含量，改善心肌缺血損傷[10]，其有效成分阿魏酸能夠抗血小板聚集、抑制膽固醇的合成，發揮抗血栓的功效。

本研究首先通過網絡藥理學方法，分析了當歸-金銀花配伍有效成分與動脈粥樣硬化疾病相關靶點，初步篩選出槲皮素、木犀草素、蘆丁、阿魏酸等重要活性成分。槲皮素與山奈酚都屬于黃酮醇類化合物，槲皮素能夠降低血液中的總膽固醇和低密度脂蛋白，提高抗氧化能力，還具有降低血糖的治療潛力。木犀草素主要通過抑制炎癥與氧化應激發揮抗動脈粥樣硬化的作用[11]，通過調節Nrf2介導的氧化應激和NF-κB介導的炎癥反應保護鏈脲霉素誘導的糖尿病小鼠的心臟組織，并且能夠通過抑制NF-κB的過度磷酸化和下調p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)磷酸化保護小鼠心肌細胞缺血損傷，抑制心肌細胞的凋亡[12]。在心肌梗死小鼠的實驗中發現，阿魏酸具有很強的抗氧化和心臟保護作用，可以通過調節自噬來抑制心肌細胞凋亡。動物實驗發現，阿魏酸可能是通過抑制炎癥因子、減少氧化低密度脂蛋白的生成，調節血脂，減少泡沫細胞形成等機制發揮抗動脈粥樣硬化作用[13]。蘆丁能夠顯著提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，平衡心臟的氧化和抗氧化系統；通過增加內皮細胞一氧化氮的產生而改善內皮功能，減輕血管平滑肌細胞的早衰[14]，從而減輕動脈粥樣硬化負擔并穩定斑塊。beta-谷甾醇則有利于改善脂蛋白狀況和主動脈功能[15]，能明顯抑制TNF-α刺激的人類主動脈內皮細胞(human artery endothelial cells，HAECs)中血管黏附分子1和細胞內黏附分子1的表達，以及U937細胞與TNF-α刺激的HAEC的結合，削弱NF-κB p65的磷酸化，從而發揮藥效。

為了進一步確證當歸-金銀花在治療動脈粥樣硬化中發揮作用的藥效基礎，接下來采用分子對接技術對篩選得到的重要成分進行驗證。一般認為結合能≤-5.0 kJ·mol-1時表明配體與受體結合發生作用的可能性較大，且構象越穩定時能量越低[16]。根據篩選結果，將前10位有效成分與前10位靶點蛋白分別進行對接，發現MAPK3和MAPK1與重要成分的對接結果均較滿意，蘆丁與MAPK3(-10.4 kJ·mol-1)、木犀草素與MAPK3(-9.5 kJ·mol-1)、蘆丁與AKT1(-9.3 kJ·mol-1)、阿魏酸與MAPK3(-6.9 kJ·mol-1)是對接較好的組合，說明當歸-金銀花可能通過抗炎、調節細胞自噬、調節細胞分化與遷移等多方面發揮作用。

本文研究發現，根據PPI及KEGG通路富集靶點預測均顯示MAPK1、MAPK3、AKT是當歸-金銀花配伍作用于AS的關鍵靶點，其次分別涉及APP、JUN、TP53與PRKCA、MAPK8、RAF1等靶點，說明MAPK家族成員在當歸-金銀花抗動脈粥樣硬化過程中扮演重要角色。經過p38激活的MAPK通路，在大鼠心肌缺血/再灌注期間會增加不良心血管事件的發生。PRKCA參與調節細胞增殖、分化、遷移、心肌細胞肥大和炎癥等，有研究發現其是小鼠心肌細胞內心肌收縮力和Ca2+穩態的關鍵調節因子，PRKCA過表達會降低心肌收縮力，而PRKCA缺乏則能預防心力衰竭[17]，但其在動脈粥樣硬化中的具體機制還有待進一步探索。有動物實驗研究表明，PI3K-Akt信號通路與冠心病過程中的抗炎和抗凋亡有關[18]。綜合以上結果推測，當歸-金銀花有效成分可能通過調控MAPK、PRKCA、PI3K-Akt信號通路，發揮抗炎、抗細胞凋亡、調控細胞自噬最終起到抗動脈粥樣硬化的作用。

本文通過網絡藥理學和分子對接技術，初步預測活血解毒中藥配伍(當歸-金銀花)的有效成分及其在抗動脈粥樣硬化的作用中發揮作用的可能靶點，為后續開展實驗驗證奠定基礎。