川芎注射液通過cAMP-CREB-BDNF通路改善卒中后抑郁大鼠神經功能

喻 斌，阮 鳴,2，許 立，李宏軼

(1. 南京中醫藥大學江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023；2. 南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 211117；3. 江蘇南星藥業有限責任公司，江蘇 南京 210046)

腦卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是腦卒中后常見的心理障礙，也是導致腦卒中患者長期致殘的主要因素之一，影響27.5%～56%的腦卒中存活者[1-2]。PSD的發生可對腦梗死患者的康復產生不利影響，包括延緩運動功能的恢復，加重認知功能障礙，甚至增加自殺的風險[2]。目前，藥物治療仍然是緩解PSD的首選。選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(如氟西汀)、5-羥色胺及去甲腎上腺素再攝取抑制劑是廣泛應用的抗抑郁藥，但由于療效不穩定，甚至伴有輕重不等的不良反應，包括視力模糊、尿潴留、性功能障礙、震顫、低血壓和嚴重失眠等而限制了它們的應用[2-3]。而傳統中藥在PSD的治療則越來越受到關注[4]。

川芎始載于《神農本草經》，為傘形科多年生草本植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，其性溫味辛，具有活血行氣、祛風止痛之效，主要成分包括生物堿、揮發油和有機酸等，臨床廣泛應用于心腦血管、神經系統等疾病的治療[5]。臨床研究報道，川芎能明顯改善PSD患者的抑郁、焦慮心理[6]。實驗研究也進一步證實了該藥，尤其是揮發油類成分在PSD治療中的積極作用[7-8]，但對于其相關治療機制卻仍不清楚。

cAMP 應答元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)是神經細胞內信號通路的重要細胞因子，可通過促進下游腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的分泌，發揮神經細胞的修復及保護效應。越來越多的研究發現，cAMP-CREB-BDNF通路的下調可能和抑郁、缺血性腦卒中、亨廷頓病，大腦炎性損傷密切相關，尤其是缺血性腦卒中的發生和發展。因此，結合已有研究成果，本課題組提出川芎注射液臨床改善PSD患者的認知能力的潛在機制可能和調節cAMP-CREB-BDNF通路有關。本實驗擬利用中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion，MCAO)復合慢性應激刺激構建大鼠PSD模型，并通過行為學、尼氏評分、neuronal nuclei(Neun)表達和cAMP-CREB-BDNF通路檢測，對川芎注射液緩解PSD的作用機制進行深入探討。

1 材料

1.1 實驗動物SD大鼠，♂，體質量(300～350)g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2018-0004。動物飼養于南京中醫藥大學實驗動物中心，使用許可證號SYXK(蘇) 2018-0049。

1.2 試劑10%川芎注射液，上海長海醫院，批號：170704；兔抗鼠Neun抗體(ab177487，Abcam)；兔抗鼠cAMP抗體(ab76238，Abcam)；兔抗鼠p-CREB抗體(ab32096，Abcam)；兔抗鼠BDNF抗體(ab108319，Abcam)；兔抗鼠GAPDH抗體(10494-1-AP，武漢三鷹)；羊抗兔Alexa Fluor 488二抗(ab150077，Abcam)；羊抗兔IgG二抗(BA1056，武漢博士德)；DAPI染色試劑盒(KGA215，南京凱基)。

1.3 儀器Morris水迷宮行為學系統(淮北正華有限公司)，配合Any-maze 行為學分析軟件(美國Stoeling公司)；R540IP型小動物麻醉系統(北京瑞沃德公司)；IX71型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；ImageQuant LAS4000 mini成像系統(美國GE公司)。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥方法大鼠分為5組，即假手術組、模型組、川芎注射液低劑量組(0.1 g·kg-1)、高劑量組(0.2 g·kg-1)，每組8只。按照前述方法略加改良進行PSD造模[9]。3%異氟烷誘導麻醉后再用1.5%異氟烷維持麻醉。分離頸外動脈、頸內動脈。結扎頸外動脈遠心端、頸總動脈近心端和翼腭動脈。距頸總動脈分叉處插入尼龍線并向前推至18±0.5 cm，多余的線栓縫合固定于皮膚。假手術組大鼠手術過程相同，但不插入尼龍線。每日給予青霉素(ip，10萬U/只)，連續3 d。隨后每只用大鼠籠單獨飼養并接受28 d的慢性應激刺激，具體包括晝夜顛倒、夾尾3 min、4 ℃水游泳5 min、160 Hz水平振蕩5 min、禁食1 d、禁水1 d、電擊2 min(30 V，電擊5 s，間隔5 s)。以上刺激重復4次以組成28次隨機刺激，1次·d-1。假手術組大鼠常規飼養。動物在接受刺激的最后5 d同時腹腔注射給藥，1次·d-1。正常組和模型組給予等體積NS。

2.2 行為學檢測

2.2.1糖水消耗實驗[10]實驗前訓練動物飲用糖水。禁水24 h后每只大鼠給予20 mL的1%蔗糖水，1 h后取走水瓶并量取剩余體積，獲取糖水消耗體積(mL)。

2.2.2Open-field test(OFT)開場實驗[10]自制無蓋敞箱，底面為黑白相間的64個等格(10 cm×10 cm)。將大鼠放入中心方格，計時3 min，以大鼠爬過時四肢均進入的格子數作為水平運動次數，以大鼠前肢離地騰空或攀附箱壁、后肢直立次數為垂直運動次數。

2.2.3Morris水迷宮實驗 按照前期研究方法進行Morris水迷宮實驗[10]。該實驗由一不銹鋼圓形水池和一平臺組成，水池直徑為100 cm，水深50 cm。先在水池內注入清水，然后加入少許墨汁使水變黑，水溫控制在(22±2) ℃。水池被分為2個區域。與站臺距離小于50 cm為近站臺區，與站臺距離大于50 cm為遠站臺區。平時訓練時間設定70 s作為逃避到平臺上的最大潛伏期，超過70 s則直接將大鼠牽引至平臺。實驗時將大鼠隨機放入任一象限，以尋找平臺的時間作為潛伏期，以尋找平臺游過的軌跡作為總路程，記錄大鼠總路程、潛伏期、近站臺區軌跡路程、遠站臺區軌跡路程、近/遠站臺區路程比。

2.3尼氏染色和Neun免疫熒光檢測 取材前12 h 禁食不禁水，3%異氟烷麻醉后脫頸椎處死大鼠，迅速以4%多聚甲醛心臟灌注固定，取左側大腦半球，經脫水、透明、浸蠟與包埋，將蠟塊常規切片。一部分進行尼氏染色后，對海馬CA1區尼氏體進行計數和評分。另一部分滴加兔抗鼠Neun一抗(1 ∶400)，37 ℃孵育2 h，漂洗后加入羊抗兔二抗(Alexa Fluor 488，1 ∶200)孵育1 h，漂洗后每張片子滴加DAPI染液50～100 μL，復染后封片觀察CA1區Neun+細胞，并利用ImageJ軟件進行熒光積分定量。

2.4 Western blot檢測cAMP, p-CREB和BDNF蛋白的表達取腦組織，分離出左側海馬組織。提取總蛋白后利用BCA法定量。以每孔20 μg上樣，并分別進行 SDS-PAGE電泳、轉膜和封閉，4 ℃孵育下列一抗過夜：cAMP(1 ∶5 000)、p-CREB(1 ∶500)、BDNF(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶10 000)。TBST洗膜3次后室溫孵育二抗，再次洗膜3次，顯色成像，利用ImageJ進行灰度和面積計算。cAMP、p-CREB和BDNF的表達分別和GAPDH進行比值，獲取各自的相對表達量。

3 結果

3.1 糖水消耗實驗結果與假手術組比較，模型組大鼠糖水消耗量明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，川芎注射液低、高劑量組均明顯升高PSD大鼠糖水飲用量(P<0.05)，見Fig 1A。

3.2 OFT實驗結果與假手術組比較，模型組大鼠的水平運動和垂直運動計數均明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組均明顯增加PSD大鼠以上兩種運動的計數(P<0.05)，見Fig 1B、C。

3.3 Morris水迷宮實驗結果與假手術組比較，模型組大鼠可見總路程、潛伏期、近站臺區軌跡路程、遠站臺區軌跡路程、近/遠站臺區路程比均明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組可明顯減少游泳總路程和近站臺區軌跡路程(P<0.05，0.01)。此外，高劑量組還可進一步減少登臺潛伏期和近/遠站臺區路程比(P<0.05)，見Fig 2A、2B。

3.4 尼氏染色檢測結果與假手術組比較，模型組大鼠不僅可見海馬CA1區尼氏體數量的明顯減少(P<0.01)，還導致尼氏體形態的固縮。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組在明顯增加尼氏體數量(P<0.05，0.01)的同時，還可恢復尼氏體形態，提示藥物對神經細胞功能的保護作用，見Fig 3A、B。

Fig 1 Results of sugar consumption test and

Fig 2 Results of Morris water maze

Fig 3 Results of Nissl n=4)

Fig 4 Results of Neun immunofluorescence n=4)

Fig 5 Expressions of cAMP-p-CREB-BDNF n=4)

3.5 Neun免疫熒光檢測結果與假手術組比較，模型組大鼠不僅可見海馬CA1區Neun熒光積分的明顯減少(P<0.01)，DAPI染色還可見核的固縮。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組可明顯減少細胞核的固縮。此外高劑量組還增加Neun熒光積分(P<0.05)，顯示了藥物對神經細胞的保護作用，見Fig 4A、4B。

3.6 cAMP、p-CREB和BDNF蛋白表達結果與假手術組比較，模型組大鼠可見海馬組織cAMP、p-CREB和BDNF表達的明顯減少(P<0.01)。與模型組比較，川芎注射液低、高劑量組可明顯增加cAMP和p-CREB的表達(P<0.05，0.01)，高劑量組還可見BDNF表達的明顯增加(P<0.01)，提示藥物對cAMP-p-CREB-BDNF通路的上調作用，見Fig 5。

4 討論

證據表明，川芎改善PSD的機制和改善腦血流、調控凋亡基因的表達、抗自由基損傷、降低免疫炎癥反應、降低興奮性氨基酸毒、調控核錄因子кB表達，以及促進神經細胞修復有關[6]。

目前，研究認為抑郁的發病機制與海馬區域神經細胞的萎縮和壞死密切相關。長期應激刺激可使該區域神經網絡的功能和結構缺陷，突觸傳遞障礙，從而導致抑郁癥時情緒和認知異常的發生。越來越多的研究證實海馬CA1區與應激反應密切相關，被認為是抑郁癥防治的重要腦區[11]。慢性應激刺激是將動物暴露于輕度而不可預知的外界刺激中，使其誘發類似于臨床抑郁癥的行為改變，如運動能力下降、蔗糖攝入減少、學習記憶能力降低以及對刺激的反應性遲緩，故被廣泛用于動物抑郁癥模型的建立[10]。

PSD往往伴隨著機體大腦神經元受損，導致快樂體驗能力的降低甚至喪失。而大鼠模型則可見其嗜甜本性的抑制，故糖水消耗量常常用作衡量快感缺失程度的重要指標[12]。開場實驗則能反映動物對新環境的探索及情緒改變，其水平活動主要體現情緒變化，而垂直活動則反應其探索欲[12]。Morris水迷宮實驗作為經典的行為學評價手段，能較為全面的評價動物學習、記憶和觀察能力，故被廣泛用于各類神經系統疾病中神經功能的評估。本次實驗發現川芎注射液低、高劑量組均明顯升高PSD大鼠糖水飲用量，增加大鼠水平和垂直運動計數，減少游泳總路程和近站臺區軌跡路程。高劑量組還縮短了登臺潛伏期，降低近/遠站臺區路程比。以上結果提示川芎注射液不僅能改善PSD大鼠對外界環境刺激的情緒反饋，提升動物的空間探索興趣，還能增加抑郁大鼠的學習記憶能力。而在Morris水迷宮實驗中對遠臺區軌跡路程并沒有縮短，只縮短近臺區路程，提示藥物在恢復記憶能力方面更加突出。

尼氏體是神經細胞胞體內的嗜堿性顆粒，其在代謝功能旺盛的神經細胞中含量豐富。當神經細胞受到損傷時，尼氏體可減少、解體甚至消失。而在損傷恢復過程中，又重新出現、增多，甚至恢復至正常水平，故尼氏體形態和數量可作為神經細胞功能狀態的標志[13]。Neun由Mullen等于1992在小鼠腦細胞核中發現，并廣泛用作脊椎動物成熟神經元的標志物[14]。本實驗發現，川芎注射液可明顯增加PSD大鼠尼氏體數量，恢復尼氏體形態，提示藥物對神經細胞功能的保護。

cAMP-CREB-BDNF通路在神經細胞修復和神經功能的恢復中具有重要作用。在正常生理條件下，單胺類神經遞質(如5-HT、DA、NE)與細胞膜上的特定G蛋白偶聯受體相互作用，激活G蛋白。后者與GTP結合后通過C2結構域激活腺苷酸環化酶，并促進cAMP的合成。cAMP與PKA的調節亞單位結合，導致PKA的催化亞單位解離并進入細胞核。在細胞核中，PKA的催化亞單位與CREB的Ser-133位點結合并磷酸化CREB。隨后p-CREB與BDNF啟動子區域的cAMP反應元件結合，調節BDNF的轉錄[15]。但在病理狀態下，持續的精神應激和刺激會導致患者體內單胺類神經遞質含量降低，cAMP信號轉導通路減弱，從而導致其下游信號分子p-CREB和BDNF表達降低。BDNF的低表達難以抵抗應激下神經元的損傷，這可導致記憶功能的缺陷、抑郁，甚至海馬體積的縮小[16-18]。本實驗發現，川芎注射液可明顯增加cAMP、p-CREB和BDNF的表達，提示藥物對cAMP-p-CREB-BDNF通路具有上調作用，而這可能是抗PSD作用的潛在機制。

綜上所述，川芎注射液可通過上調cAMP-CREB-BDNF通路，增加BDNF的表達，進而改善PSD大鼠行為學和神經功能，保護海馬CA1區神經細胞，最終改善PSD大鼠認知功能。