奧沙利鉑抑制EGFR-MAPK促進HCT116細胞凋亡

崔 珊，黃金清，韋東雪，余龍龍，江紹鋒

(桂林醫學院基礎醫學院，廣西腫瘤免疫與微環境調控重點實驗室，廣西 桂林 541199)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全世界最常見的腫瘤之一[1]，致病原因復雜，發病率及復發率高。奧沙利鉑(oxaliplatin，OXA)是第三代鉑類化療藥的代表藥物，與DNA發生交聯后細胞周期停滯，誘導細胞凋亡，但在臨床發現嚴重毒副作用[2]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在細胞生長和凋亡中起關鍵作用[3]。抑制MAPK/ERK信號通路促進細胞凋亡[4]，因此探究奧沙利鉑通過EGFR-MAPK信號通路中EGFR-RAS-RAF-ERK1/2的信號級聯反應產生的作用機制，為奧沙利鉑靶向用藥及臨床應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料人結腸癌細胞HCT116購自中國科學院細胞庫(TCHu 99)，奧沙利鉑購自北京索萊寶科技有限公司(產品批號No.324F021)。β-actin(TA-09)購自北京中杉金橋生物技術有限公司，B-RAF(SAB4502855)及RAS(SAB4301113)抗體購自Sigma，Bcl-2(15071S)、Bax(89477S)、ERK1/2(4695S)、p-ERK1/2(8544S)、EGFR(4267S)和p-EGFR(3777S)等抗體購自CST。

1.2 實驗方法

1.2.1奧沙利鉑的配制 稱1 mg的奧沙利鉑溶解于1 mL的無菌水中，將藥物按所需10、20和40 mg·L-1濃度加入培養基，現用現配。空白對照組加入無菌水。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 將HCT116細胞接種到96孔板中，貼壁后加入不同濃度的OXA，孵育24 h。加10 μL的MTT溶液(5 g·L-1)，4 h后棄掉廢液，加150 μL的DMSO溶液，在37 ℃孵育10 min。在酶標儀490 nm波長測定吸光度。

1.2.3細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 將HCT116細胞接種于6孔板中，用10 μL的移液槍頭劃直線，沖洗后加入不同濃度的OXA培養24 h，拍照并計算劃痕創面愈合程度。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞侵襲 小室鋪基質膠后加入不同濃度的OXA上室無血清的培養基和下室為20%胎牛血清的培養基，將細胞接種到上室中培養24 h，固定染色，觀察細胞數目并拍照。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達水平 HCT116細胞培養基中培養并加藥處理24 h，消化并收集細胞沉淀，進行蛋白定量、電泳、轉膜、封閉、一抗及二抗的孵育并發光處理的過程。所有實驗至少重復3次，并用Image J進行分析。

2 結果

2.1 OXA抑制細胞活力HCT116細胞分別用0、10、20及40 mg·L-1的奧沙利鉑處理24 h。與對照組相比，24 h的存活率為100.00 %、79.09 %、62.20 %及41.81 %，呈顯著性抑制作用(P<0.05)。

2.2 OXA抑制細胞遷移及侵襲通過細胞劃痕和Transwell實驗，發現與對照組相比，OXA顯著抑制HCT116細胞的遷移及侵襲，具有濃度依賴性(P<0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Inhibition of cell migration and

2.3 OXA抑制EGFR-MAPK信號通路蛋白并促進凋亡蛋白的表達Western blot實驗對EGFR-RAS-RAF-ERK1/2的蛋白進行水平檢測。OXA對EGFR、p-EGFR、RAS、B-RAF、ERK1/2及p-ERK1/2呈抑制作用，差異有統計學意義(P<0.05)，見Tab 2。與空白組相比，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達隨OXA濃度增加而降低；促凋亡蛋白Bax的表達為先升高后降低的趨勢，見Tab 2。

Tab 2 Effect of OXA on protein expression

3 討論

OXA作為鉑類代表藥物參與多種腫瘤的治療，并為晚期結直腸癌的一線藥物。目前OXA耐藥機制尚不清晰，聯合治療成為OXA減少用量和減輕毒副作用的有效手段。通過實驗發現，奧沙利鉑通過抑制EGFR-RAS-RAF-ERK1/2的信號級聯反應來抑制HCT116的增殖、遷移及侵襲并促進其凋亡，進一步驗證抑制ERK1/2后促進凋亡[5]。EGFR-MAPK是奧沙利鉑對結腸癌靶向治療中的重要信號通路。奧沙利鉑發揮表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)作用對HCT116細胞產生抑制作用。