補陽還五湯對脊髓損傷大鼠磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路及神經功能影響※

李 江 潘 樂 雍 晨 劉 闖 譚龍旺

(陜西中醫藥大學附屬醫院脊柱病區，陜西 咸陽 712000)

應用中藥治療脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可以取得顯著療效，且不良反應少，越來越受到學者的關注，但其分子生物學機制尚未明確。目前大眾最常研究的是SCI發生后某些信號轉導通路被激活，使脊髓神經元具有一定有限的自我修復和再生功能，來促進神經功能的恢復。補陽還五湯作為益氣活血通絡名方，臨床及文獻報道治療SCI有良好的療效。本實驗通過觀察補陽還五湯對大鼠SCI后大鼠神經細胞巢蛋白(Nestin)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號通路活性的影響，以及在該信號通路被特異性阻斷劑雷帕霉素抑制的情況下，補陽還五湯是否還可以發揮神經保護作用，以揭示補陽還五湯參與促進脊髓神經功能恢復的機制，為其應用于臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康6個月齡雌性SD大鼠96只，體質量250～300 g,實驗前大鼠適應性飼養7 d。實驗動物生產許可證號：SCXK(陜)2018-0032，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心。飼養濕度40%～70%，溫度26 ℃，晝夜12 h間斷照明。

1.2 實驗藥品及試劑 補陽還五湯濃縮液藥物組成(由陜西中醫藥大學制劑室制備)：黃芪120 g，當歸6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，加工成4 g/mL濃度藥液，無菌封瓶，-20 ℃冰箱保存備用。雷帕霉素(美國Sigma公司)、注射用青霉素鈉(成都倍特藥業股份有限公司，國藥準字H13021731)、10%水合氯醛(天津市大茂化學試劑廠)。

總RNA提取試劑盒、RNA RT-PCR試劑盒(一步法)(廣州銳博生物技術有限公司)；蛋白激酶B單克隆抗體(Akt)、抗mTOR小鼠單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology 公司)；兔抗-巢蛋白(Nestin)多克隆抗體(英國Abcam公司)、兔抗β-Actin多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記親和純化山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗；蛋白酶和磷酸酶抑制劑(北京諾為生物技術有限公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、RIPA裂解液(強)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(美國Millipore公司)等。

1.3 實驗儀器 Centrifuge 5424R離心機(德國Eppendorf 公司)；Mini-protean 3 cell電泳儀(美國BIO-RAD公司)；Tanon-5200全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)；Tanon-2500全自動數碼凝膠成像分析系統(上海天能科技有限公司)；BI-2000醫學圖像分析系統(成都泰盟軟件有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及造模 96只大鼠采用隨機數字表法分為正常組、模型組、補陽還五湯組、阻斷組4組，每組24只。除正常組外，其余各組均采用改良Allen法建立SCI大鼠模型，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，背部皮膚備皮，以胸椎(T)8～9棘突為中心，逐層切開，將T8～9部分棘突及椎板去除，顯露硬膜，將10 g砝碼從2.5 cm高處自由落下，擊中硬膜和脊髓組織，造成局部SCI模型。建模成功標志為出現大鼠尾巴擺動痙攣、下肢麻痹。大鼠造模后分籠單籠飼養；術后保暖，人工按摩大鼠膀胱每日2次至能自主排尿；術后1周內前肢肌肉注射注射用青霉素鈉8×104U，每日1次。

1.4.2 給藥 補陽還五湯組于術后第2天用4 g/mL濃度的補陽還五湯濃縮液灌胃，每日2次，每次灌胃劑量按人60 kg體質量每日1劑換算，大鼠等效用藥劑量約為0.217 g/kg(分2次灌胃)，連續灌胃3周。阻斷組在補陽還五湯給藥基礎上于術后第2天予雷帕霉素3 mg/kg，每日1次腹腔注射，連續3周。正常組、模型組術后予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日2次，連續灌胃3周。

1.5 觀察指標 為排除實驗結果的偶然性，增加實驗結果的可靠程度，取材檢測過程中每組隨機抽取6只大鼠。術后3周各組分別隨機選取6只大鼠，評定大鼠后肢運動功能后，處死大鼠，以損傷區為中心取2 cm脊髓組織，縱切等分后置于液氮中，用于檢測各實驗組大鼠神經細胞Nestin，以及通路中Akt、mTOR的蛋白和mRNA表達水平。

1.5.1 聯合行為評分(CBS) 用于評定大鼠后肢運動功能的恢復情況，包括：開放空間運動、觸地反應、腳趾伸展、回縮反應、斜板試驗、端正體位和游泳等[1]。評分值：正常0分，全癱100分。

1.5.2 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Nestin、Akt、mTOR蛋白表達 用RIPA裂解液，加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑裂解脊髓組織。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清液并用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白濃度。每孔8 μg的總蛋白樣品經濃度為5%～17% SDS-聚丙烯胺凝膠電泳后，轉入PVDF膜(0.45 μmol/L)，將膜用2%的封閉蛋白干粉室溫封閉2 h后，分別加Nestin、p-Nestin、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR(Ser2448)(1∶1000)、β-actin(1∶400)一抗4 ℃孵育過夜，經磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3次后加HRP標記的二抗(1∶5000)37 ℃孵育2 h。經PBST充分漂洗后，目的蛋白信號由增強化學發光法檢測并曝光于X線片上。采用Western blot半定量分析Nestin、p-Nestin、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR(Ser2448)，其中p-Akt、p-mTOR的相對光密度表達為各條帶的累積光密度比相應的Akt、mTOR的累積光密度，其相對光密度表達為每條帶的累積光密度比相應的β-actin。

1.5.3 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA表達 脊髓組織液氮中勻漿后，RNA 提取試劑盒提取總RNA，將提取的總RNA(8 μL)加入逆轉錄反應體系混合(共20 μL)，合成cDNA。實驗樣品總RNA的提取及RT-PCR的操作步驟均按照試劑盒說明書進行。反應條件設定如下：①Nestin：40℃ 30 min、90℃ 5 min、5℃ 10 min，1個循環；95℃ 5 min；90 ℃變性30 s，50℃退火30 s，73℃延伸30 s，20個循環；70℃ 10 min。②Akt:40℃ 30 min、95℃ 5 min、5℃ 10 min，1個循環；96℃ 5 min；93℃變性35 s，55 ℃退火30 s，74℃延伸30 s，25個循環；75℃ 10 min。③mTOR:45℃ 30 min、95℃ 5 min、5℃ 10 min，1個循環；93 ℃ 5 min；94℃變性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸 30 s,共25個循環；72℃ 10 min。反應完成后，采用Tanon-2500全自動數碼凝膠圖像分析系統將凝膠結果錄入電腦，采用BI-2000醫學圖像分析系統分析實驗結果，計算Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA與β-actin mRNA的比值，作為各目的基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

2 結果

2.1 各組大鼠CBS比較 補陽還五湯組CBS低于模型組、阻斷組(P<0.05)。模型組、阻斷組CBS組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠CBS比較 分，

2.2 各組大鼠Nestin、Akt、mTOR蛋白相對表達量比較 Western blot檢測結果顯示，與正常組比較，模型組Akt、mTOR蛋白相對表達量均升高(P<0.05)，Nestin表達增加但比較差異無統計學意義(P>0.05)，補陽還五湯組、阻斷組Nestin、Akt、mTOR蛋白相對表達量均升高(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組Nestin、Akt、mTOR蛋白相對表達量均升高(P<0.05)，阻斷組Nestin、Akt、mTOR蛋白相對表達量無明顯升高或降低(P>0.05)；與補陽還五湯組比較，阻斷組Nestin、Akt、mTOR蛋白相對表達量均降低(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組大鼠Nestin、Akt、mTOR蛋白相對表達量比較

圖1 各組大鼠Nestin、Akt、mTOR蛋白相對表達量比較

2.3 各組大鼠Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對含量比較 RT-PCR檢測結果顯示，與正常組比較，模型組Akt mRNA、mTOR mRNA相對含量均升高(P<0.05)，Nestin mRNA相對含量增加，但比較差異無統計學意義(P>0.05)，補陽還五湯組、阻斷組Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對含量均升高(P<0.05)；與模型組比較，補陽還五湯組Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對含量均升高(P<0.05)，阻斷組3種Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對含量無明顯升高或降低(P>0.05)；與補陽還五湯組比較，阻斷組Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對含量均降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對含量比較

3 討論

實驗發現，SCI后，通過阻斷或促進來干預神經再生的信號通路，可以抑制神經細胞凋亡、促進神經再生恢復[2]。在眾多的信號通路中，最常見的調控通路是PI3K/Akt信號通路，通過適當調節上游相關因子(如生長因子、營養因子、壓力刺激因子等)位點，將信號整合分析后，最終激活下游一系列效應因子的改變，從而調控神經元細胞分化、存活、凋亡[3]。

PI3K下游的直接靶點蛋白是Akt，Akt在調控各種不同細胞功能(包括代謝、生長、增殖、存活、轉錄以及蛋白質合成)方面發揮重要作用。PI3K被激活后，促使Akt從細胞質轉移到細胞膜上進行磷酸化，使Akt完全被激活。Akt及胞外調節蛋白激酶(ERK)磷酸化水平的增加能夠啟動PI3K/Akt信號通路下游聯合反應，進一步磷酸化下游的B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子(Bad)、mTOR、半胱天冬酶3(caspase-3)等系列底物，從而發揮細胞調控作用，對抗神經元凋亡并促進神經元存活。因此，目前大部分通過Akt通路發揮促細胞存活、抗細胞凋亡的研究，主要是通過磷酸化Akt下游系列底物來實現的[4]。Akt下游明星分子mTOR則是調節生長與代謝的這樣的一個樞紐分子，通過磷酸化下游mTOR可以起到調節自噬[5]、改善組織局部微環境的作用，同時，實驗證實可以通過特異性阻斷劑雷帕霉素來阻斷該作用[6]。胡凌云等[7]也證實，通過ATP激活Akt/mTOR/p70S6K信號通路，SCI后Nestin及NeuN的陽性細胞表達明顯增加，并且此通路可以被雷帕霉素阻斷，從而降低陽性細胞的表達。

實驗研究表明，PI3K/Akt/mTOR通路參與了SCI后神經修復的過程，如大鼠SCI早期神經功能的自我重建有關[8-9]。并且由此通路介導的某些miRNAs參與了SCI后的病理、生理過程,在SCI后可以出現異常的表達，可以通過調控miRNAs來促進脊髓功能恢復[10-13]，使內源性神經干細胞重新獲得向神經元細胞增殖和分化能力，從而促進神經功能恢復。沈黎明[14]研究證實，調控miR-181d-5p位點可以抑制PTEN基因的表達，激活PI3K/Akt通路，從而促進神經細胞軸突的伸長。此外，也有研究發現，體外細胞移植干預后也可以激活PI3K/Akt/mTOR通路，如腎下腹主動脈移植骨髓間充質干細胞(BMSCs)后，SCI病灶局部VEGF表達增加，進而介導其下游信號通路PI3K/Akt的激活，促進SCI大鼠神經功能恢復[15]；移植神經調節蛋白1(NRG1)轉染的雪旺細胞能夠有效促進SCI大鼠神經功能的恢復，其機制可能也與激活mTOR信號通路有關[16]。

隨著現代醫學及分子生物學的發展，發現很多中藥復方改善和保護神經的作用都是基于PI3K/Akt信號通路，因為其中藥活性成分良好的安全性及耐藥性，受到了越來越多的關注與研究。本研究所用補陽還五湯出自清·王清任《醫林改錯》，主治氣虛血瘀證，具有補氣、活血、通絡的功效，本方既是益氣活血法的代表方，又是治療中風后遺癥的常用方。現代臨床常用于治療腦血管意外后遺癥及各種原因引起的偏癱、截癱、半身不遂、肢體痿軟等屬氣虛血瘀者[17]。臨床觀察證實補陽還五湯對SCI的恢復具有促進作用[18]。

中醫學認為，SCI所致的肢體萎軟無力，甚至偏癱、截癱等證屬督脈受損，瘀血阻絡，傷后多久臥活動不便，久臥傷氣，故氣虛血瘀之證多見，患者常見苔白，脈緩，亦為氣虛佐證，且亦屬于“因虛致瘀”。脊髓解剖結構同古人所描述的督脈十分相似，現代中醫認為SCI會導致督脈受損。SCI的病機屬本虛標實, 本虛為肝腎、氣血虧虛, 標實是指瘀血和痰濁阻滯經絡。中醫治療SCI以補養氣血、活血祛瘀、通督為原則，兼顧強筋骨、填精補髓。補陽還五湯方中生黃芪為君藥，重用以大補脾胃之元氣，使氣旺血行，瘀去絡通；臣以當歸尾活血兼養血，有化瘀而不傷血之妙；佐以地龍通經活絡，赤芍、川芎、桃仁、紅花助當歸活血祛瘀，具有活血通絡、益氣之功效。研究表明，補陽還五湯方中的生物堿、苷、多糖、苷元是其主要有效部位[19-20]。顧志榮等[21]對具有神經保護作用的中藥進行總結分析，發現其主要分布在補益藥的苷類及多糖類成分，清熱藥的生物堿類，還有部分活血藥中。而補陽還五湯的配伍特點正是大量的補氣藥(黃芪)與適當的活血藥(當歸、赤芍、桃仁、紅花)相配，使氣旺血行，活血不傷正。這也從側面印證了古代醫家應用本方治療神經損傷用藥的合理性，與現代生物學的研究結果不謀而合。研究證實，補陽還五湯可以改善SCI大鼠的運動能力，其效果與糖皮質激素甲基強的松龍相當，可能與升高脊髓組織中再生基因蛋白2(Reg-2)和少突膠質細胞轉錄因子2(Olig-2)蛋白及抑制mTOR蛋白表達有關，促進神經膠質細胞分裂增殖活性，減輕炎性反應，進而發揮保護神經元的作用[22]。補陽還五湯還可以抑制過度的內質網應激反應，下調Caspase-3、Caspase-9及Caspase-12的表達[23]，增加Ⅰ型膠原蛋白和Ⅳ型膠原蛋白表達，從而改善SCI后大鼠的肢體運動功能障礙[24]。

Nestin最早在胚胎大鼠的脊髓神經管神經前體細胞(NPCs)上發現表達，在胚胎期, Nestin表達強度隨著神經細胞的不斷成熟,逐漸減弱甚至消失, 當機體成年后,室管膜細胞即處于“靜止”狀態,當受到損傷后,又會應激而重新進入分化的活躍狀態。Nestin陽性細胞為神經干細胞(NSCs)前體細胞,Nestin為NSCs的自我更新所需[25]，實驗中常用來表示神經細胞功能的改善指標。

本研究結果表明，補陽還五湯干預SCI大鼠后，PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活，神經細胞Nestin表達及Akt、mTOR蛋白明顯增多，CBS評分明顯優于模型組(P<0.05)；將PI3K/Akt/mTOR信號通路阻斷后，功能改善情況不及未阻斷的補陽還五湯組，且與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。說明補陽還五湯是通過PI3K/Akt/mTOR信號通路來實現SCI神經功能的改善。補陽還五湯激活PI3K/Akt/mTOR信號通路的機制可能是促使發生PI3K磷酸化，進而促使Akt從細胞質轉移到細胞膜上，在3-磷脂酰肌醇依賴性激酶1(PDK1)和PDK2的協同作用下促進Akt磷酸化，從而使Akt完全被激活[26]。

綜上所述，補陽還五湯能夠通過激活PI3K/Akt/mTOR通路，促進神經細胞Nestin表達，參與SCI神經功能的修復，并且可以被阻斷劑阻斷降低療效，為以后臨床中應用補陽還五湯治療SCI提供了現代醫學理論基礎。