黃曲霉毒素B1 免疫層析試紙條和ELISA 試劑盒中花生粕樣本適用性優化

張君超，田秀梅，王 艷，閔國春，靳 曼，陳 年

（1.北京美正生物科技有限公司，北京 102200；2.湖北省孝感市公共檢驗檢測中心，湖北孝感 432000；3.三峽公共檢驗檢測中心，湖北宜昌 443000；4.遼寧省糧食檢驗檢測中心，遼寧沈陽 110032）

中國是花生種植大國，花生年產量從2017 年連續5 年在1 700 萬t 以上，是全球花生主要產區。目前國內花生仍以榨油和食用為主，花生粕是花生果仁經壓榨等方式制油后產生的副產品，由于花生種皮薄、粗纖維含量低，壓榨后的花生粕蛋白質含量高且氨基酸種類豐富，可以應用在食品、保健品和飼料中[1-2]。但由于花生粕中精氨酸、賴氨酸和蛋氨酸等氨基酸不平衡和大分子蛋白質消化利用率低，以及在貯存過程中極易發生霉變而產生黃曲霉毒素等原因，影響了花生粕蛋白的廣泛、綜合使用[3-4]。隨著花生粕深加工技術的發展以及飼用豆粕減量替代行動方案的實施，花生粕近年來在食品和飼料中的應用更為廣泛。

黃曲霉毒素是曲霉屬真菌的次生代謝產物，主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1和G24 種，其中AFB1的毒性和致癌性最強，嚴重影響食品和飼料的質量安全[5-6]。目前花生粕中黃曲霉毒素B1的檢測方法有液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法、電化學法、酶聯免疫吸附法、時間分辨熒光免疫層析法、膠體金快速定量法和膠體金定性法等多種方法[7-8]。液相色譜-串聯質譜、高效液相色譜等儀器檢測方法的準確度高、穩定性好、靈敏度高，已作為法檢方法使用，但儀器設備相對昂貴、對檢測人員的要求高，不適合在食品加工企業、飼料加工企業以及花生粕原料貿易中廣泛應用。而基于免疫學的快速檢測方法因其快速、簡便、成本低的特點，適用于基層用戶現場大批量快速檢測，在基層中應用較為廣泛[9-10]。因此，花生粕中黃曲霉毒素B1含量的快速、準確測定對于食品及飼料質量安全控制意義重大。

為在基層檢測中更加準確地檢出花生粕中黃曲霉毒素B1，給予生產及貿易企業有效的參考，本實驗在原有商業化快速檢測產品的基礎上，通過對比不同提取溶劑對花生粕中黃曲霉毒素B1快速檢測結果的影響，選取了最優的提取溶劑用于酶聯免疫吸附法、熒光/膠體金免疫層析快速定量法等快速檢測方法。本實驗增加了黃曲霉毒素B1的快速檢測商品化產品中花生粕樣本的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料

花生粕樣品：來源于油脂生產企業、花生粕貿易企業和飼料加工企業。

1.2 主要試劑與儀器

乙腈、甲醇均為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司）；黃曲霉毒素B1ELISA 檢測試劑盒、黃曲霉毒素B1熒光快速定量檢測試紙條和黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測試紙條（北京華安麥科生物技術有限公司）。

天平（PL602E，梅特勒-托利多）；多管渦旋儀（HMG-WX，北京美正生物科技有限公司）；離心機（TG16-W，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；酶標分析儀（HF4500，北京華安麥科生物技術有限公司）；熒光定量快速檢測及監測分析系統（HYG001，北京華安麥科生物技術有限公司）和膠體金定量快速檢測及監測分析系統（HMG001，北京華安麥科生物技術有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 花生粕中黃曲霉毒素B1檢測方法

①酶聯免疫法。除提取溶劑外，前處理方法和檢測方法參照黃曲霉毒素B1ELISA 檢測試劑盒（北京華安麥科生物技術有限公司）產品說明書。②熒光/膠體金免疫層析快速定量法。除提取溶劑外，前處理方法和檢測方法參照黃曲霉毒素B1膠體金/熒光快速定量檢測試紙條（北京華安麥科生物技術有限公司）產品說明書。

1.3.2 酶聯免疫法中不同提取溶劑對花生粕中黃曲霉毒素B1檢測結果的影響

根據黃曲霉毒素B1自身理化性質、現行的檢測方法常用到的提取溶劑以及商品化快速檢測產品的有機溶劑耐受性，選取60%甲醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水3 種溶劑提取，經《飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的測定 液相色譜-串聯質譜法》（NY/T 2071—2011）定值的花生粕樣本，使用黃曲霉毒素B1ELISA 檢測試劑盒檢測，對比不同提取溶劑對檢測結果的影響。

1.3.3 熒光/膠體金快速定量免疫層析法中不同提取溶劑對花生粕中黃曲霉毒素B1檢測結果的影響

根據黃曲霉毒素自身理化性質、現行的檢測方法常用到的提取溶劑以及商品化快速檢測產品的有機溶劑耐受性，選取50%乙醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水3 種溶劑提取，經《飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的測定 液相色譜-串聯質譜法》（NY/T 2071—2011）定值的花生粕樣本，使用黃曲霉毒素B1熒光/膠體金快速定量檢測試紙條檢測，對比不同提取溶劑對檢測結果的影響。

2 結果與分析

2.1 酶聯免疫法中不同提取溶劑對花生粕中黃曲霉毒素B1 檢測結果的影響

花生粕經60%甲醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水不同提取溶劑提取后使用商品化黃曲霉毒素B1ELISA 檢測試劑盒檢測結果如表1 所示。結果顯示，與定值結果相比，用60%甲醇-水溶劑提取的樣品檢測結果偏低，回收率在68.1%～78.5%；而用80%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結果偏高，回收率在120.7%～203.0%；用30%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結果的回收率在95.1%～109.0%。實驗結果表明，不同提取溶劑的提取效率有所差異，對于所使用的商品化ELISA 檢測試劑盒來講，其更適合使用30%乙腈-水溶劑提取花生粕中黃曲霉毒素B1。

表1 酶聯免疫法檢測花生粕中黃曲霉毒素B1

2.2 熒光定量免疫層析法中不同提取溶劑對花生粕中黃曲霉毒素B1 檢測結果的影響

花生粕經50%乙醇-水、30%乙腈-水、80%乙腈-水不同提取溶劑提取后，使用商品化黃曲霉毒素B1熒光快速定量檢測試紙條檢測結果如表2 所示。實驗結果顯示，與定值結果相比，用50%乙醇-水溶劑提取的樣品檢測結果偏低，回收率在46.8%～73.7%；用80%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結果也偏低，回收率在59.0%～73.1%；而用30%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結果回收率在88.5%～99.9%。結果表明不同提取溶劑的提取效率有所差異，對于所使用的商品化熒光快速定量檢測試紙條來講，其更適合使用30%乙腈-水溶劑提取花生粕中黃曲霉毒素B1。

表2 熒光定量免疫層析法檢測花生粕中黃曲霉毒素B1

2.3 膠體金定量免疫層析法中不同提取溶劑對花生粕中黃曲霉毒素B1 檢測結果的影響

花 生 粕 經50% 乙 醇- 水、30% 乙 腈- 水、80%乙腈-水不同提取溶劑提取后，使用商品化黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測試紙條檢測結果如表3 所示。結果顯示，與定值結果相比，用50%乙醇-水溶劑提取的樣品檢測結果偏低，回收率在56.2%～66.9%；用80%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結果也偏低，回收在67.2%～84.9%；而用30%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測結果的回收在84.5%～103.3%。結果表明不同提取溶劑的提取效率有所差異，對于所使用的商品化膠體金快速定量檢測試紙條來講，其更適合使用30%乙腈-水溶液提取花生粕中黃曲霉毒素B1。

表3 膠體金定量免疫層析法檢測花生粕中黃曲霉毒素B1

3 結論

本實驗結果顯示，商品化黃曲霉毒素B1快速檢測花生粕的結果因提取溶劑的不同，回收率不同，現有商品化快速檢測產品中提取溶劑不適用花生粕的檢測。經對比，30%乙腈-水提取溶劑均適用于商品化黃曲霉毒素B1ELISA 檢測檢測試劑盒、黃曲霉毒素B1熒光快速定量檢測試紙條和黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測試紙條。食品加工企業、飼料加工企業以及花生粕原料貿易可使用此方法對花生粕中黃曲霉毒素B1進行快速檢測。

本實驗是基于現有商品化快速檢測產品進行開展，并未對市面上所有商品快速檢測產品進行研究，此提取溶劑不一定適用于其他商品化快速檢測產品。不同提取溶劑的選擇對液相色譜-串聯質譜法和高效液相色譜法等儀器檢測方法是否也有同樣的影響還需進一步探討及研究。