黃曲霉毒素B1 免疫層析試紙條和ELISA 試劑盒中花生粕樣本適用性優(yōu)化

張君超，田秀梅，王 艷，閔國(guó)春，靳 曼，陳 年

（1.北京美正生物科技有限公司，北京 102200；2.湖北省孝感市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北孝感 432000；3.三峽公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北宜昌 443000；4.遼寧省糧食檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧沈陽(yáng) 110032）

中國(guó)是花生種植大國(guó)，花生年產(chǎn)量從2017 年連續(xù)5 年在1 700 萬(wàn)t 以上，是全球花生主要產(chǎn)區(qū)。目前國(guó)內(nèi)花生仍以榨油和食用為主，花生粕是花生果仁經(jīng)壓榨等方式制油后產(chǎn)生的副產(chǎn)品，由于花生種皮薄、粗纖維含量低，壓榨后的花生粕蛋白質(zhì)含量高且氨基酸種類(lèi)豐富，可以應(yīng)用在食品、保健品和飼料中[1-2]。但由于花生粕中精氨酸、賴(lài)氨酸和蛋氨酸等氨基酸不平衡和大分子蛋白質(zhì)消化利用率低，以及在貯存過(guò)程中極易發(fā)生霉變而產(chǎn)生黃曲霉毒素等原因，影響了花生粕蛋白的廣泛、綜合使用[3-4]。隨著花生粕深加工技術(shù)的發(fā)展以及飼用豆粕減量替代行動(dòng)方案的實(shí)施，花生粕近年來(lái)在食品和飼料中的應(yīng)用更為廣泛。

黃曲霉毒素是曲霉屬真菌的次生代謝產(chǎn)物，主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1和G24 種，其中AFB1的毒性和致癌性最強(qiáng)，嚴(yán)重影響食品和飼料的質(zhì)量安全[5-6]。目前花生粕中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法、電化學(xué)法、酶聯(lián)免疫吸附法、時(shí)間分辨熒光免疫層析法、膠體金快速定量法和膠體金定性法等多種方法[7-8]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜等儀器檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、靈敏度高，已作為法檢方法使用，但儀器設(shè)備相對(duì)昂貴、對(duì)檢測(cè)人員的要求高，不適合在食品加工企業(yè)、飼料加工企業(yè)以及花生粕原料貿(mào)易中廣泛應(yīng)用。而基于免疫學(xué)的快速檢測(cè)方法因其快速、簡(jiǎn)便、成本低的特點(diǎn)，適用于基層用戶現(xiàn)場(chǎng)大批量快速檢測(cè)，在基層中應(yīng)用較為廣泛[9-10]。因此，花生粕中黃曲霉毒素B1含量的快速、準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)于食品及飼料質(zhì)量安全控制意義重大。

為在基層檢測(cè)中更加準(zhǔn)確地檢出花生粕中黃曲霉毒素B1，給予生產(chǎn)及貿(mào)易企業(yè)有效的參考，本實(shí)驗(yàn)在原有商業(yè)化快速檢測(cè)產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)比不同提取溶劑對(duì)花生粕中黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)結(jié)果的影響，選取了最優(yōu)的提取溶劑用于酶聯(lián)免疫吸附法、熒光/膠體金免疫層析快速定量法等快速檢測(cè)方法。本實(shí)驗(yàn)增加了黃曲霉毒素B1的快速檢測(cè)商品化產(chǎn)品中花生粕樣本的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料

花生粕樣品：來(lái)源于油脂生產(chǎn)企業(yè)、花生粕貿(mào)易企業(yè)和飼料加工企業(yè)。

1.2 主要試劑與儀器

乙腈、甲醇均為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；黃曲霉毒素B1ELISA 檢測(cè)試劑盒、黃曲霉毒素B1熒光快速定量檢測(cè)試紙條和黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測(cè)試紙條（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）。

天平（PL602E，梅特勒-托利多）；多管渦旋儀（HMG-WX，北京美正生物科技有限公司）；離心機(jī)（TG16-W，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；酶標(biāo)分析儀（HF4500，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）；熒光定量快速檢測(cè)及監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)（HYG001，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）和膠體金定量快速檢測(cè)及監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)（HMG001，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 花生粕中黃曲霉毒素B1檢測(cè)方法

①酶聯(lián)免疫法。除提取溶劑外，前處理方法和檢測(cè)方法參照黃曲霉毒素B1ELISA 檢測(cè)試劑盒（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。②熒光/膠體金免疫層析快速定量法。除提取溶劑外，前處理方法和檢測(cè)方法參照黃曲霉毒素B1膠體金/熒光快速定量檢測(cè)試紙條（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.3.2 酶聯(lián)免疫法中不同提取溶劑對(duì)花生粕中黃曲霉毒素B1檢測(cè)結(jié)果的影響

根據(jù)黃曲霉毒素B1自身理化性質(zhì)、現(xiàn)行的檢測(cè)方法常用到的提取溶劑以及商品化快速檢測(cè)產(chǎn)品的有機(jī)溶劑耐受性，選取60%甲醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水3 種溶劑提取，經(jīng)《飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（NY/T 2071—2011）定值的花生粕樣本，使用黃曲霉毒素B1ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，對(duì)比不同提取溶劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1.3.3 熒光/膠體金快速定量免疫層析法中不同提取溶劑對(duì)花生粕中黃曲霉毒素B1檢測(cè)結(jié)果的影響

根據(jù)黃曲霉毒素自身理化性質(zhì)、現(xiàn)行的檢測(cè)方法常用到的提取溶劑以及商品化快速檢測(cè)產(chǎn)品的有機(jī)溶劑耐受性，選取50%乙醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水3 種溶劑提取，經(jīng)《飼料中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2 毒素的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（NY/T 2071—2011）定值的花生粕樣本，使用黃曲霉毒素B1熒光/膠體金快速定量檢測(cè)試紙條檢測(cè)，對(duì)比不同提取溶劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶聯(lián)免疫法中不同提取溶劑對(duì)花生粕中黃曲霉毒素B1 檢測(cè)結(jié)果的影響

花生粕經(jīng)60%甲醇-水、30%乙腈-水和80%乙腈-水不同提取溶劑提取后使用商品化黃曲霉毒素B1ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果如表1 所示。結(jié)果顯示，與定值結(jié)果相比，用60%甲醇-水溶劑提取的樣品檢測(cè)結(jié)果偏低，回收率在68.1%～78.5%；而用80%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測(cè)結(jié)果偏高，回收率在120.7%～203.0%；用30%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測(cè)結(jié)果的回收率在95.1%～109.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同提取溶劑的提取效率有所差異，對(duì)于所使用的商品化ELISA 檢測(cè)試劑盒來(lái)講，其更適合使用30%乙腈-水溶劑提取花生粕中黃曲霉毒素B1。

表1 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)花生粕中黃曲霉毒素B1

2.2 熒光定量免疫層析法中不同提取溶劑對(duì)花生粕中黃曲霉毒素B1 檢測(cè)結(jié)果的影響

花生粕經(jīng)50%乙醇-水、30%乙腈-水、80%乙腈-水不同提取溶劑提取后，使用商品化黃曲霉毒素B1熒光快速定量檢測(cè)試紙條檢測(cè)結(jié)果如表2 所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與定值結(jié)果相比，用50%乙醇-水溶劑提取的樣品檢測(cè)結(jié)果偏低，回收率在46.8%～73.7%；用80%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測(cè)結(jié)果也偏低，回收率在59.0%～73.1%；而用30%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測(cè)結(jié)果回收率在88.5%～99.9%。結(jié)果表明不同提取溶劑的提取效率有所差異，對(duì)于所使用的商品化熒光快速定量檢測(cè)試紙條來(lái)講，其更適合使用30%乙腈-水溶劑提取花生粕中黃曲霉毒素B1。

表2 熒光定量免疫層析法檢測(cè)花生粕中黃曲霉毒素B1

2.3 膠體金定量免疫層析法中不同提取溶劑對(duì)花生粕中黃曲霉毒素B1 檢測(cè)結(jié)果的影響

花 生 粕 經(jīng)50% 乙 醇- 水、30% 乙 腈- 水、80%乙腈-水不同提取溶劑提取后，使用商品化黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測(cè)試紙條檢測(cè)結(jié)果如表3 所示。結(jié)果顯示，與定值結(jié)果相比，用50%乙醇-水溶劑提取的樣品檢測(cè)結(jié)果偏低，回收率在56.2%～66.9%；用80%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測(cè)結(jié)果也偏低，回收在67.2%～84.9%；而用30%乙腈-水溶劑提取的樣品檢測(cè)結(jié)果的回收在84.5%～103.3%。結(jié)果表明不同提取溶劑的提取效率有所差異，對(duì)于所使用的商品化膠體金快速定量檢測(cè)試紙條來(lái)講，其更適合使用30%乙腈-水溶液提取花生粕中黃曲霉毒素B1。

表3 膠體金定量免疫層析法檢測(cè)花生粕中黃曲霉毒素B1

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，商品化黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)花生粕的結(jié)果因提取溶劑的不同，回收率不同，現(xiàn)有商品化快速檢測(cè)產(chǎn)品中提取溶劑不適用花生粕的檢測(cè)。經(jīng)對(duì)比，30%乙腈-水提取溶劑均適用于商品化黃曲霉毒素B1ELISA 檢測(cè)檢測(cè)試劑盒、黃曲霉毒素B1熒光快速定量檢測(cè)試紙條和黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測(cè)試紙條。食品加工企業(yè)、飼料加工企業(yè)以及花生粕原料貿(mào)易可使用此方法對(duì)花生粕中黃曲霉毒素B1進(jìn)行快速檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)是基于現(xiàn)有商品化快速檢測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行開(kāi)展，并未對(duì)市面上所有商品快速檢測(cè)產(chǎn)品進(jìn)行研究，此提取溶劑不一定適用于其他商品化快速檢測(cè)產(chǎn)品。不同提取溶劑的選擇對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜法等儀器檢測(cè)方法是否也有同樣的影響還需進(jìn)一步探討及研究。