超高效液相色譜-三重四極桿/復合線性離子阱質譜法檢測白酒中甜味劑

倪小龍，吳金凱，陸雪梅，梅 婕，張溫清，周 萍

（1.宣城市食品藥品檢驗中心，安徽宣城 242000；2.安徽宣酒集團股份有限公司科研技術中心，安徽宣城 242000）

白酒，中國傳統的文化飲品，是老百姓餐桌上不可或缺的一部分，每年的生產量、消費量都很大，因此白酒也是日常監督抽檢重點食品之一。白酒在異常發酵釀造的過程中會產生一些苦味物質，影響口感，而部分小作坊為了掩蓋此缺陷違規添加甜味劑，以次充好，因此歷年來國家或省地區白酒抽檢中，甜味劑檢出屢見不鮮[1]?！妒称钒踩珖覙藴适称诽砑觿┦褂脴藴省罚℅B 2760—2014）[2]中對甜味劑的使用有著嚴格的規定，純糧固態發酵的白酒中不允許添加，因此檢測白酒中甜味劑對白酒質量日常監管和自身企業質量控制都有重大意義?，F階段白酒甜味劑檢測國標方法多為單一種類檢測，如《食品安全國家標準 食品中環己基氨基磺酸鈉的測定》（GB 5009.97—2016）[3]采用的是超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用法，而在實際檢測中發現，該方法在低濃度檢測時存在基質干擾，且其采用的是正負離子同時掃描，正離子響應較低，不能準確定性，容易出現漏判、誤判。三氯蔗糖目前按照《食品安全國家標準 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》（GB 22255—2014）[4]檢測，但因其檢測靈敏度太低，在低濃度范圍，該方法無法使用。出入境檢驗標準《出口食品中六種合成甜味劑的檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》（SN/T 3538—2013）[5]采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用法同時檢測6 種甜味劑，但其檢測范圍不包含白酒，而且甜蜜素也只提供一個離子對，不符合質譜檢測定性要求等問題。愛得萬甜、麥芽糖醇目前尚未見白酒中的國標檢測方法。本研究旨在使用超高效液相色譜三重四極桿與離子阱聯用（Ultra Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Composite Linear Ion Trap Mass Spectrometry，UPLC-QTRAP）技術一步法同時檢測白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜、阿力甜、三氯蔗糖、麥芽糖醇及愛得萬甜9 種常見甜味劑，在保證定量準確性的同時，減少檢測假陽性率，為白酒監管以及白酒質量控制提供有效技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、阿力甜、紐甜、阿斯巴甜液體標準品，購自于北京壇墨質檢標準品有限公司；麥芽糖醇（純度99.0%）、三氯蔗糖（純度99.7%）、愛德萬甜（純度99.7%）固體標準品，購自于上海安譜有限公司；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨，均為HPLC 級，購自于上海安譜有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-三重四極桿線性復合離子阱 質 譜 儀AB 5500QTRAP， 美 國SCIEX 公 司；phenomenex kinetex F5（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）、phenomenex kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），美國菲羅門公司；電熱恒溫水浴鍋XMTD-400，上海科恒實業發展有限公司；電子天平AL204，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Millipore 超純水機，美國Millipore 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取50.0 mg固體標準品，分別用50%甲醇-水溶解定容至50 mL，得到濃度為1.0 mg/mL 單標儲備母液。取每種單標儲備母液0.5 mL，用50%甲醇-水稀釋定容至50 mL，得到濃度為10.0 μg/mL 混標中間液，于≤5 ℃避光保存。系列混合標準工作液（0.025 ～1.000 μg/mL）使用50%甲醇-水連續稀釋得到，現用現配。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取白酒樣品5.0 g 置于燒杯中，于80 ℃水浴加熱20 min，殘渣全部轉至50 mL 容量瓶中，用水定容并搖勻，經0.22 μm 水相微孔濾膜過濾于樣品瓶中，上機測試。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：phenomenex kjnetex F5，柱溫45 ℃，流動相：A 流動相為0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨水溶液，B 流動相為乙腈，流速為0.4 mL/min，二元高壓模式。進樣量5 μL，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.4 質譜條件

離子源：TurboV 電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）負離子掃描；霧化氣（Gas1/Gas2）：50/50 Psi；離子化溫度：500 ℃；離子噴霧電壓（Ion Spray，IS）：-4 500 V；氣簾氣（Curtain Gas，CUR）：35 Psi；掃描模式：多反應監測-信息關聯采集-增強子離子（多反應監測-信息關聯采集-增強子離子（Multi Reaction Monitoring-Information Dependent Acquisition-Enhancer Ion，MRM-IDA-EPI）。 化 合物攝入電壓：-10 eV；碰撞室射出電壓：-16 eV；碰撞模式：HIGH；碰撞氣：氮氣。IDA：峰閾值為1 600 cps。EPI：碰撞能量（Collision Energy，CE）為-35 eV，碰撞能量擴展（Collision Energy Spread，CES）為15 eV。使用SCIEX OS 1.7 軟件對儀器進行控制采集以及數據分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

用1.0 μg/mL 混標溶液進樣，依據各化合物的分子質量，使用Q1 掃描模式確定ESI 負離子模式下準分子離子峰即確定母離子質荷比；選擇所確定的母離子，用二級子離子模式掃描，確定離子碎片信息，選定2 對響應最強的特征離子作為定性離子，以響應值最大碎片離子為定量離子，用MRM 模式，得到最優的CE 和DP 值，初步建立質譜分析方法，優化結果見表2。

經過優化得到9 種化合物的質譜參數，包括保留時間、定性定量離子對、去簇電壓（Declustering Potential，DP）及碰撞能量（Collision Energy，CE），如表2 所示。

表2 9 種甜味劑的保留時間和質譜參數

2.2 色譜條件優化

由于需采用MRM-IDA-EPI 模式進行采集，質譜掃描駐留時間僅8 ms，所以超高效液相色譜需要得到良好的色譜峰形，以滿足分析要求。實驗對比了phenomenex kinetex F5、phenomenex kinetex C182款色譜柱，2 款色譜柱均能實現白酒中9 種甜味劑的分離，但在濃度為25 ng/mL 時，phenomenex kinetex F5 色譜柱得到的S/N值更高，故選用此款色譜柱，如表3 所示。

表3 25 ng/mL 混標不同色譜柱S/N 值比較結果

2.3 EPI 普庫的建立

通常超高效液相色譜三重四極桿質譜的MRM模式是通過定性離子對的保留時間、質荷比、相對豐度比進行定性。UPLC-QTARP 的MRM-IDA-EPI掃描方式，不僅可以使用MRM 定性模式，還增加了二級譜庫的匹配用于定性分析，由于離子阱的富集功能，在低濃度時可以有效提高離子響應值，從而降低結果的假陽性率。該方法在MRM 分析的基礎上，以預定義的信息關聯采集標準自動觸發增強子離子二級質譜掃描，其離子阱富集功能可獲得高靈敏度的二級質譜信息。利用混合標準品溶液，通過MRM-IDA-EPI 模式采集在-20 eV、-35 eV、-50 eV 3 中碰撞能量下的質譜圖，建立可搜索EPI 二級譜庫。將樣品分析時獲得的EPI 二級譜圖與譜庫進行匹配搜索，通過正向和反向匹配的得分值判斷是否為目標物，得分越高則定性結果的準確度越高。如在實際檢測中，對含1 ng/mL 甜蜜素的白酒樣品，用EPIP 譜圖庫搜索匹配分仍有80 分。該方法通過一次進樣同時滿足了高靈敏度的定量分析和基于譜庫的定性檢測需求。9 種化合物質量色譜圖譜圖見圖1，1 ng/mL 甜蜜素樣品提取離子譜圖見圖2，1 ng/mL甜蜜素樣品EPI 譜圖搜索結果見表4。

表4 1 ng/mL 甜蜜素EPI 譜圖搜索結果

圖1 9 種甜味劑質量色譜圖

圖2 1 ng/mL 甜蜜素提取離子譜圖

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

使用50%甲醇-水配制混合標準工作液25 ～1 000 ng/mL，過0.22 μm 水相微孔濾膜過濾上機，以定量離子的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。9 種甜味劑線性關系良好，相關系數R均大于0.995。按照信噪比（S/N）=3和S/N=10 計算方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），檢出限（LOD）分別在0.001 ～0.048 mg/kg，定量限（LOQ）為0.004 ～0.160 mg/kg。具體詳見表5。

表5 9 種甜味劑線性方程、相關系數、檢出限、定量限

2.4.2 回收率和精密度

選取未檢出甜味劑的白酒作為本底，進行3 種濃度水平0.25 mg/kg、0.50 mg/kg、1.00 mg/kg 的添加實驗，重復測定6 次。結果如表6 所示，樣品平均加標回收率為80.9%～110.1%，RSD 為3.78%～11.80%，均滿足樣品痕量檢測要求。

表6 白酒中9 種甜味添加回收率和精密度（n=6）

2.5 市售白酒樣品的測定

按照上述優化、建立的白酒9 種甜味劑測試方法，于市場上隨機選取了醬香型白酒、清香型白酒、濃香型白酒、濃香型、鳳香型、清香型、稻谷香型、兼香型及小作坊自釀純糧酒等40 個樣品進行檢測分析，其中甜蜜素檢出3 份，濃度分別為0.025 mg/kg、0.013 mg/kg、0.260 mg/kg，三氯蔗糖檢出1 份，濃度為0.96 mg/kg，其余均為未檢出。

（續表6）

3 結論

本研究建立了UPLC-QTARP 方法同時檢測白酒9 種甜味劑的方法，本方法前處理簡單、快速、靈敏度高、在低濃度時判定陽性可靠度高，適用于白酒中安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜、阿力甜、三氯蔗糖、愛得萬甜及麥芽糖醇的檢測。