高效液相色譜法測定食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素以及香豆素的研究

管淑霞，林新傳，都 穎

（食品藥品檢驗檢測研究院，山東威海 264400）

香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素都具有香莢蘭豆香氣及濃郁的奶香，其中乙基香蘭素香氣更是香蘭素的3 ～4 倍，且留香持久[1]。這幾種香料用途廣泛，主要起增香和定香作用，廣泛用于食品、日用化妝品、煙草等行業[2]。香豆素一般存在于黑香豆、香蛇鞭菊、野香莢蘭和蘭花中，具有新鮮干草香和香豆香，但一般不作食用，允許煙用和外用。據歐盟專家委員會2000 年2 月24 日報道，人體大量攝入香蘭素等食品添加劑可導致頭痛、惡心、嘔吐和呼吸困難等癥狀，嚴重的可能會損傷肝、腎[3]?！妒称钒踩珖覙藴?食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）中允許使用的食品用合成香料名單有1 477種，其中包括香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素，食品分類中約有28 種食品沒有加香的必要，不得添加食品用香料、香精。標準中也明確規定了較大嬰兒和幼兒配方食品中可使用香蘭素、乙基香蘭素，最大使用量均為5 mg/100 mL；嬰幼兒谷類輔助食品中可使用香蘭素，最大使用量為7 mg/100 g，其中100 g和100 mL 都以即食食品計，是生產企業按照沖調比例折算成食品中的使用量；而使用范圍涵蓋0 ～6個月嬰幼兒配方食品不得添加任何食品用香料[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方乳粉、牛奶糖、飲料，均購自本地超市；香蘭素標準品（C8H8O3，CAS 號121-33-5，天津阿爾塔科技有限公司，編號S087267，100 μg/mL）；甲基香蘭素標準品（C9H10O3，CAS 號120-14-9，天津阿爾塔科技有限公司，編號S078875，100 μg/mL）；乙基香蘭素標準品（C9H10O3，CAS 號121-32-4，天津阿爾塔科技有限公司，編號S086815，100 μg/mL）；香豆素標準品（C9H6O2，CAS 號91-64-5，天津阿爾塔科技有限公司，編號S077371，100 μg/mL）；甲醇；乙腈（色譜純）；有機系微孔濾膜（孔徑0.45 μm，天津市津騰實驗設備有限公司）。

1.2 儀器與設備

1260 高效液相色譜儀（帶二極管陣列檢測器），Agilent；QUINTIX224-1CN電子天平，德國賽多利斯；V4DS025 渦旋混合器，德國艾卡；G-16C 高速冷凍離心機，德國賽多利斯；氮氣濃縮裝置；超聲波發生器。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

（1）甲醇-水溶液（4+1）。將甲醇400 mL 和水100 mL 混合均勻。

（2）鹽酸溶液（1 mol/L）。吸取8.33 mL 濃鹽酸，定容至100 mL 水中，臨用現配。

1.3.2 試樣制備及測定

將牛奶糖粉碎，飲料搖勻備用，乳粉直接用于試樣提取。稱取1.00 g 試樣，嬰幼兒配方乳粉加入10 mL 水和480 μL 鹽酸溶液，糖果及飲料加入5 mL水，溶解，渦旋振蕩1 min，加入乙腈20 mL，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min 后，加入氯化鈉5 g，渦旋振蕩2 min，8 000 r/min，離心5 min，將上清液轉移至玻璃試管，40 ℃氮吹至近干，準確加入1.0 mL 甲醇-水溶液溶解殘渣，過0.45 μm 微孔濾膜后，待測[5]。

將試樣溶液注入高效液相色譜儀中，得到峰面積，根據標準曲線得到試樣溶液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的濃度。

1.3.3 標準品的配制

吸取香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素 標 準 液（100 μg/mL）各1 mL 混 合成25 μg/mL 的溶液，-18 ℃避光保存，保存期3 個月。分別吸取適量25 μg/mL 混合標準儲備液8 μL、40 μL、200 μL、400 μL 和1 000 μL，用甲醇-水溶液定容至1 mL，配成濃度為0.2 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL 和25.0 μg/mL 標準工作液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：C18柱，250 mm×4.6 mm，5μm；柱溫：30 ℃；檢測波長：279 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A 相為0.5%甲酸溶液，B 相為乙腈；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫表

2 結果與分析

2.1 線性范圍及檢出限

在1.3.4 色譜條件下，對標準工作曲線進行測定，得到4 種化合物的線性范圍、線性相關系數及回歸方程，在3 倍信噪比的進樣濃度水平下計算檢出限。在0.2 ～25.0 μg/mL，香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的峰面積均與濃度線性關系良好，相關系數均大于0.999 9，檢出限為0.05 ～0.07 mg/kg，結果如表2 所示。

表2 4 種化合物的線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限

2.2 加標實驗

以不含香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的奶粉為空白樣品基質，分別計算0.1 mg/kg、0.2 mg/kg 和0.3 mg/kg 3 個加標水平下4 種化合物的回收率。4 種化合物的加標回收率為96.1%～108.7%，結果如表3 所示。

表3 4 種化合物的加標實驗結果

2.3 精密度實驗

用樣品加入0.1 mg/kg 混合標準液連續進樣6 次進行檢測，得出精密度為1.27%～3.00%，結果如表4 所示。

表4 4 種化合物的精密度實驗結果

2.4 食品檢測結果

對市售的幾種嬰幼兒乳粉、牛奶糖、飲料進行檢測，結果如表5 所示。除嬰幼兒配方乳粉、酸奶外，其他幾款食品都在配料上標注添加了食用香精。通過表5 能看出部分食品都不同程度地檢測出了香蘭素與乙基香蘭素，由于未設定限量，各類食品添加量也不同，往往奶香味越足的食品香精含量也越高。

表5 市售食品4 種香精的檢測結果（單位：mg/kg）

3 結論與討論

有研究表明，香蘭素、乙基香蘭素的少量攝入對人體沒有危害，但對于6 個月以內的嬰幼兒來說，可能會破壞他們的食欲。嬰幼兒的身體器官未發育成熟，代謝排毒能力較差，攝入含有食品添加劑的食物會加重其日常代謝的負擔。過多攝入，還可能會造成偏食、厭食、挑食等問題，養成不良的飲食習慣。市售的多種奶味飲品、糖果均檢測出香蘭素，兩款飲品檢測出乙基香蘭素，因此要注意不要過早給嬰幼兒食用各種飲品。本文參照GB 5009.284—2021采用高效液相色譜法測定食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素，標準曲線線性關系良好、方法的檢出限及回收率符合相關標準的要求，能滿足實驗室對食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素以及香豆素的檢測要求，可以為有關市場監管部門加強嬰幼兒乳粉中香精檢測提供技術支持。