高效液相色譜法測定保健食品中蘆薈苷的不確定度評定

伍 曦

（貴州省食品檢驗檢測院，貴州貴陽 550001）

測量不確定度（Uncertainty of Measurement）是測量結果關聯的一個參數，用于表征合理賦予被測量值的分散性。由測量所得的值只是被測量的估計值，測量過程中的隨機性及系統性均會導致測量不確定度。完整的測量結果應包含被測量的估計值以及與測量不確定度有關的信息[1]。不確定度評定在實驗室檢驗檢測、實驗室質量控制以及官方檢測報告中越來越受到重視。蘆薈苷，又稱為蘆薈素、蘆薈甙，其主要為好望角蘆薈、庫拉索蘆薈、斑紋蘆薈等的提取物。蘆薈苷具有抗菌性，可以促進血液循環、凈化血液、軟化血管、降低血液黏度與血壓，從而降低動脈硬化和腦溢血的發生率[2]。因此，在保健食品中應用比較廣泛。然而，蘆薈苷易被分解氧化為蘆薈大黃素，蘆薈大黃素結構與大黃素相似，這種1,8-二羥基蒽醌結構，有致癌和腎損傷危險[3]。因此，在含蘆薈苷的保健食品中測定蘆薈苷的含量尤為重要。根據《化學分析不確定度評定》（JJF 1135—2005）和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012），采用高效液相色譜法對保健食品中蘆薈苷的含量進行測定，建立其不確定度的模型，分析在實驗過程中所產生的不確定度來源，找到主要的影響因素，以提高檢測結果的準確度，為選擇蘆薈苷含量測定的方法及結果的質量控制提供科學有效的依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：型號e2695，Waters；電子天平：型號XS205DU，METTLER TOLEDO；超聲波清洗機：型號KQ-500DA，昆山市超聲儀器有限公司；蘆薈苷標準品：中國食品藥品檢驗研究院，95.0%，110787- 201206；甲醇：色譜純，默克；實驗用水為去離子水，純水制備系統為Millipore 公司生產，型號為Milli-Q。

1.2 檢測方法

1.2.1 標準溶液的配制

精密稱取14.80 mg 蘆薈苷（中國食品藥品檢驗研究院，95.0%，110787-201206）置于10 mL 容量瓶中，加入55%甲醇溶解混勻。準確移取上述溶液1 mL 于25 mL 容量瓶中，用55%甲醇定容，搖勻待用。

1.2.2 標準曲線的繪制

精密吸取蘆薈苷標準溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL 和13 μL，依次注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以蘆薈苷的量（ng）為橫坐標，響應值峰面積（A）為縱坐標建立線性回歸方程。

1.2.3 樣品制備

將樣品混勻，準確稱取1 g，置于50 mL容量瓶中，加55%甲醇適量超聲5 min，加55%甲醇定容至刻度，經0.45 μm 濾膜過濾上機。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO C185.0 μm，4.6 mm×250 mm；柱號：AKAD09668；流動相：55 ∶45（甲醇∶水）；流速：1.0 mL/min；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：293 nm；進樣量：10 μL。

2 數學模型

蘆薈苷含量計算公式如下：

式中：X為樣品中蘆薈苷含量，mg/kg；C為標準曲線上讀出的蘆薈苷的濃度，μg/mL；V為樣品最終定容體積，mL；m樣為樣品稱樣量，g。

3 測量不確定度來源分析

由圖1 知，樣品中蘆薈苷含量x的合成相對不確定度為：

圖1 保健食品中蘆薈苷的測定不確定度來源

4 不確定度分量的量化

4.1 樣品產生的相對標準不確定度urel(C樣)

4.1.1 樣品稱量引起的相對標準不確定度urel(m)

（1）天平的分辨力u1萬分之一的天平，天平的分辨力為0.1 mg，屬于均勻分布，不確定度為u1=0.29×0.000 1=0.000 029 g。

（2）天平的變動性u2稱量的變動性引入的不確定度，準確至±0.000 1 g，按均勻分布不確定為因此蘆薈苷樣品相對標準不確定度為則其對樣品產生的相對標準不確定度為urel(m)=0.000 064 6。

4.1.2 樣品定容過程及樣品進樣量所引起的相對標準不確定度urel(V)

體積的標準測量不確定度分量主要由容器體積的不確定度、容器和溶液溫度與校正溫度不同所引起的不確定度組成。

本次試驗中樣品的定量總體積為50 mL，使用50 mL A 級量瓶定容，允許誤差分別為±0.05 mL[4]，按照均勻分布換算成標準偏差分別為容量瓶和溶液溫度與校正時的溫度不同引起的體積不確定度，本次試驗中的環境溫度與校準時基本相同，此因素引起的不確定度可忽略不計。得出相對不確定度為：

4.2 對照溶液濃度C對的相對標準不確定度分量urel(Cs)

4.2.1 標準溶液配制

56.24 μg/mL 蘆薈苷對照溶液是由標準品（1 406 μg/mL）稀釋制得。不確定度來源包括對照品本身的不確定度、稀釋過程中不確定度和進樣量引起的不確定度。

（1）天平的分辨力u1十萬分之一的天平，天平的分辨力為0.01 mg，屬于均勻分布，不確定度為u1=0.29×0.000 1=0.000 029 g

（2）天平的變動性u2稱量的變動性引入的不確定度，準確至±0.000 01 g，按均勻分布不確定為因此蘆薈苷標準品相對標準不確定度為則其對標準系列產生的標準不確定度為urel(m標)=0.000 436。

4.2.2 標準溶液稀釋時移液產生的標準不確定度urel(C稀)

相對標準不確定度分量主要由容器體積的不確定度、容器充滿液體至其刻度的估讀誤差，以及容器和溶液溫度與校正溫度不同引起的不確定度組成。

稱取0.014 80 g 蘆薈苷標準品于10 mL 容量瓶中，得到近148 μg/mL 的標準使用液。稀釋過程使用1 mL 移液管吸取標準儲備液，25 mL 容量瓶定容，得到混合標準使用液。1 mL 移液管所產生的標準不確定度為容量瓶的最大允許誤差為±0.03 mL，按照均勻分布評定，則容量瓶和溶液溫度與校正時的溫度不同引起的體積不確定度，在本試驗中環境溫度與校準時相同，該因素引起的不確定度忽略不計。上述不確定度分量相互獨立，合成得：

將urel(m標)，urel(C稀)合成得urel(Cs)=0.004 12。

4.3 繪制標準曲線求cx 時產生的相對標準不確定度urel(L)

按1.2.4 高效液相色譜儀的條件，測定蘆薈苷的峰面積，線性方程為A=ac+b=2.514 9c+1.801 3，r=1.000 0。將進樣量ng 換算成進樣體積為10 μL 時的濃度曲線分別為cx=55.16 μg/mL，方程為A=25.148 6c+1.801 3，不同濃度下蘆薈苷的峰面積如表1 所示，線性回歸法測量蘆薈苷不確定度計算過程如表2 所示。

表1 不同濃度下蘆薈苷的峰面積

表2 線性回歸法測量蘆薈苷不確定度計算過程

則標準曲線繪制過程中，求cx時產生的相對標準不確定度為urel(L)=0.012 2。

式中：u為繪制標準曲線求cx時產生的標準不確定度，μg/mL；a為標準曲線斜率；b為標準曲線截距；p為樣品溶液的測定次數；n為標準系列的測定次數；C—為標準系列溶液蘆薈苷濃度的平均值，μg/mL；Ci為標準系列溶液蘆薈苷的濃度，μg/mL；Ai為標準系列溶液的峰面積。

4.4 平行試驗重復性引起的相對標準不確定度urel(R)的計算

對樣品進行了6 次重復測量，進樣量10 μL，其測量結果及標準偏差如表3 所示。

由表3 可知，樣品6 次重復測量含量的標準偏差為0.003 1，則保健食品中蘆薈苷含量的測量標準不確定度為相對標準不確定度

表3 樣品6 次重復測量結果

4.5 樣品中蘆薈苷含量檢測的合成相對標準不確定度為urel(x)的評定

高效液相色法測定保健食品中蘆薈苷含量的測量不確定度匯總見表4。

表4 相對標準不確定度分量表

代入公式（1）得到：

則蘆薈苷含量測量的合成標準不確定度為：

4.6 擴展不確定度的分析

取包含因子k=2（近似95%置信概率），則擴展不確定度為：

擴展不確定度是根據合成標準不確定度乘以包含因子k=2 得到，其置信概率近似為95%，按近似于正態分布處理。

4.7 結果報告

5 結論

本文根據《化學分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）標準和不確定度文獻，結合本研究進行高效液相色譜法測定保健食品中蘆薈苷含量的不確定度評定，按照實驗過程選出不確定度的來源包括測量重復性、稱量、定容以及標準溶液配制等過程。根據計算模型計算出各步驟的相對標準不確定度分量值，由最后結果可得知標準曲線所產生的不確定度最大，其次是標準溶液的配制。因此，在實驗過程中應該盡量選擇準確度較高的標準品、容量瓶和移液管來進行標準溶液的配制，同時盡量使樣品中蘆薈苷的含量介于標準曲線的中間部分。