高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法在食品中四環(huán)素類藥物殘留檢測中的應(yīng)用

趙 琪

（哈爾濱海關(guān)技術(shù)中心齊齊哈爾綜合實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161000）

高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法在四環(huán)素類藥物殘留檢測中應(yīng)用廣泛，該方法具有分離度高、分析速度快及靈敏性強(qiáng)等優(yōu)勢，深受檢測單位青睞，同時該方法的研究發(fā)展也推動了食品中藥物殘留檢測領(lǐng)域的發(fā)展。隨著科技的發(fā)展，食品類別不斷增加，同時食品組分、加工方法、加工步驟等日益煩瑣復(fù)雜，為食品中藥物殘留檢測增加了難度。在開展藥物殘留檢測時，由于食品組分分離不徹底，會對最終的檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，而利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法可有效解決存在的問題。質(zhì)譜法和色譜法均是檢測四環(huán)素類藥物的方法之一，但從實際應(yīng)用結(jié)果來看，由于質(zhì)譜法在定量分析時過于煩瑣，應(yīng)用時受到限制，而色譜法定性能力較弱，因此兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的出現(xiàn)為更精確地檢測四環(huán)素類藥物在食品中的殘留提供了保障[1]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土霉素（TC）標(biāo)準(zhǔn)品、四環(huán)素（OTC）標(biāo)準(zhǔn)品、金霉素（CTC）標(biāo)準(zhǔn)品及美他環(huán)素（MTC）標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所。內(nèi)標(biāo)物地塞米松（DM），中國藥品生物制品檢定所；純牛奶，沈陽蒙牛達(dá)能乳制品有限公司；甲醇，色譜純；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LCQ 型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Finnigan 公司）；色譜柱（Hypersil BDS C18，150 mm×5.0 mm，5 μm，大連依利特科學(xué)儀器有限公司）；MT 型樣品凈化富集柱（250 mg，天津富集色譜技術(shù)開發(fā)公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

取牛奶樣品2 mL，加入2 mL 水，充分混合攪拌均勻。分別使用5 mL甲醇和10 mL水活化C18小柱，使用注射器吸取10 mL 牛奶混合液體以1 mL/min 的速度過C18小柱，棄去流出液，用10 mL 水洗滌小柱，空氣吹干柱，用1 mL 含4%甲酸的甲醇溶液以1 mL/min 的流速洗脫小柱，收集液體，取50 μL 進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC/MS/MS）測定[2]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

使用甲醇分別將4 種標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分別向標(biāo)準(zhǔn)貯備液中加入不同量的甲醇配制成1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL 和50.0 μg/mL 的四環(huán)素、土霉素、美他環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液和2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL 和100.0 μg/mL 的金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用甲醇將內(nèi)標(biāo)物地塞米松配制成1 mg/mL 的貯備液，向地塞米松貯備液中加入甲醇稀釋至20 μg/mL。

取7支具塞試管，分別加入2 mL牛奶樣品及0.1 mL 20 μg/mL 地塞米松內(nèi)標(biāo)溶液，再分別加入不同濃度的四環(huán)素、土霉素、美他環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液各0.1 mL，以及的不同濃度的金霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL，分別加入2 mL 水，混合均勻[3]。

1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜分析條件

流動相為甲醇和水，流速為0.5 mL/min；選用電噴霧離子源（ESI+），噴射電壓4.2 kV；毛細(xì)管溫度180 ℃；毛細(xì)管電壓30 kV；鞘氣（N2）流速0.75 L/min； 輔 助 氣（N2）流 速0.15 L/min； 掃 描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測。采用全掃描一級質(zhì)譜（FullScanMS）、二級質(zhì)譜（FullScanMS/MS）測定[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 四環(huán)素類藥物的電噴霧質(zhì)譜

基于現(xiàn)有研究資料分析，4 種四環(huán)素類藥物的結(jié)構(gòu)組成見圖1，結(jié)合4 種四環(huán)素藥物的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)行試驗檢測。經(jīng)過儀器分析，準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+質(zhì)荷比（m/z）結(jié)果為四環(huán)素為445.4，土霉素為461.2，金霉素為478.9，美他環(huán)素為443.2。選擇[M+H]+峰進(jìn)行二級全掃描質(zhì)譜（MS/MS）分析，產(chǎn)生的碎片離子基峰m/z結(jié)果為四環(huán)素為427.0，土霉素為443.0，金霉素為461.3，美他環(huán)素為426.1。四環(huán)素、土霉素及金霉素產(chǎn)生的[M+H-18]+碎片離子為分子脫H2O 形成，但美他環(huán)素中的[M+H-17]+碎片離子是分子脫NH3后形成。內(nèi)標(biāo)物地塞米松的準(zhǔn)分子離子峰m/z為473，其二級質(zhì)譜m/z為435。

圖1 4 種四環(huán)素類藥物的分子結(jié)構(gòu)

2.2 方法的專屬性、線性范圍及檢測限

將空白牛奶和分別添加1 μg/mL 的土霉素（TC）、四環(huán)素（OTC）、金霉素（CTC）和美他環(huán)素（MTC）的空白牛奶進(jìn)行全掃描一級質(zhì)譜（FullScanMS）、二級質(zhì)譜（FullScanMS/MS）測定，最終檢出結(jié)果如圖2 所示?；跈z測結(jié)果分析，牛奶中的內(nèi)源性物質(zhì)對四環(huán)素類藥物的檢測不存在影響，不會影響檢測結(jié)果的精確度。經(jīng)過線性回歸分析，在0.1 ～5.0 μg/mL，四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.631 9x+0.259 6，r=0.998 3；土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.510 3x+0.079 5，r=0.993 9；美他環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.703 1x+0.203 3，r=0.992 4。在0.2 ～10.0 μg/mL 內(nèi)，金 霉 素 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 為y=0.303 9x+0.137 6，r=0.994 9。本實驗采用的檢測方法對牛奶中四環(huán)素類的檢出限分別為四環(huán)素、土霉素、美他環(huán)素均為0.05 μg/mL，金霉素為0.1 μg/mL。

圖2 四環(huán)素類藥物的選擇性反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

2.3 回收率和精密度實驗

為了研究本次分析實驗采用的分析方法對牛奶樣品中4 種四環(huán)素類藥物的實際檢測效果，向牛奶樣品中分別添加1 μg/mL 的4 種四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，經(jīng)過檢測分析，四環(huán)素類藥物的平均回收率為四環(huán)素98.1%、土霉素95.2%、金霉素88.3%和美他環(huán)素86.9%。

以相對標(biāo)準(zhǔn)差結(jié)果表示精密度，實驗過程中分別向2 mL 牛奶樣品中添加1 μg/mL 四環(huán)素類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為四環(huán)素12.2%、土霉素12.8%、金霉素3.2%和美他環(huán)素15.0%（n=5）。

3 討論

在實驗檢測過程中，正離子檢測方式下土霉素、四環(huán)素及金霉素的質(zhì)譜斷裂方式相似，存在共同點(diǎn)，即在MS2質(zhì)譜都優(yōu)先失去H2O，獲得[M+H-H2O]+，在MS3時再進(jìn)一步丟失NH3，形成[M+H-H2O-NH3]+的碎片離子。但四環(huán)素類藥物中美他環(huán)素質(zhì)譜斷裂規(guī)律存在差異，其在MS2時未產(chǎn)生脫水的碎片離子，而是從分子中脫去一個氨分子，產(chǎn)生[M+H-NH3]+離子。從結(jié)構(gòu)來看，美他環(huán)素與四環(huán)素、金霉素、土霉素存在的主要區(qū)別是其在6 位碳原子上沒有羥基，而質(zhì)譜碎片的主要區(qū)別是不能產(chǎn)生脫水碎片離子。因此，經(jīng)過本次檢測實驗分析，雖然四環(huán)素類藥物中存在多個羧基，但其是通過脫掉6-羥基才形成MS2的脫水碎片離子。此外，要想充分測定食品中的四環(huán)素類藥物殘留情況，科學(xué)處理檢測樣品也同樣重要，以牛奶為例，通常會采用基質(zhì)固相分散（Matrix Solid-Phase Dispersion，MSPD）法、McIlvaine-EDTA 緩沖液稀釋提取法等進(jìn)行處理，在處理過程中為保證檢測效果需對C18柱進(jìn)行凈化處理，需嚴(yán)格遵守相關(guān)要求進(jìn)行操作[5]。

4 結(jié)論

綜上所述，本文通過應(yīng)用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法開展檢測實驗，對牛奶中殘留的四環(huán)素類藥物進(jìn)行檢測，結(jié)合檢測結(jié)果，更為全面地分析了高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法在食品中四環(huán)素類藥物殘留檢測中的應(yīng)用，并分析出食品中四環(huán)素類藥物殘留檢測需要注意的事項，希望通過本文研究，為高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法的推廣應(yīng)用及進(jìn)一步發(fā)展提供支持。