高效液相色譜質譜聯用法在食品中四環素類藥物殘留檢測中的應用

趙 琪

（哈爾濱海關技術中心齊齊哈爾綜合實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161000）

高效液相色譜質譜聯用法在四環素類藥物殘留檢測中應用廣泛，該方法具有分離度高、分析速度快及靈敏性強等優勢，深受檢測單位青睞，同時該方法的研究發展也推動了食品中藥物殘留檢測領域的發展。隨著科技的發展，食品類別不斷增加，同時食品組分、加工方法、加工步驟等日益煩瑣復雜，為食品中藥物殘留檢測增加了難度。在開展藥物殘留檢測時，由于食品組分分離不徹底，會對最終的檢測結果產生影響，而利用高效液相色譜質譜聯用法可有效解決存在的問題。質譜法和色譜法均是檢測四環素類藥物的方法之一，但從實際應用結果來看，由于質譜法在定量分析時過于煩瑣，應用時受到限制，而色譜法定性能力較弱，因此兩種方法各有優缺點，高效液相色譜質譜聯用法的出現為更精確地檢測四環素類藥物在食品中的殘留提供了保障[1]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土霉素（TC）標準品、四環素（OTC）標準品、金霉素（CTC）標準品及美他環素（MTC）標準品，中國藥品生物制品檢定所。內標物地塞米松（DM），中國藥品生物制品檢定所；純牛奶，沈陽蒙牛達能乳制品有限公司；甲醇，色譜純；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

LCQ 型液相色譜-質譜聯用儀（Finnigan 公司）；色譜柱（Hypersil BDS C18，150 mm×5.0 mm，5 μm，大連依利特科學儀器有限公司）；MT 型樣品凈化富集柱（250 mg，天津富集色譜技術開發公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

取牛奶樣品2 mL，加入2 mL 水，充分混合攪拌均勻。分別使用5 mL甲醇和10 mL水活化C18小柱，使用注射器吸取10 mL 牛奶混合液體以1 mL/min 的速度過C18小柱，棄去流出液，用10 mL 水洗滌小柱，空氣吹干柱，用1 mL 含4%甲酸的甲醇溶液以1 mL/min 的流速洗脫小柱，收集液體，取50 μL 進行液相色譜質譜（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC/MS/MS）測定[2]。

1.3.2 標準工作溶液配制

使用甲醇分別將4 種標準品配制成1 mg/mL 的標準貯備液，分別向標準貯備液中加入不同量的甲醇配制成1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL 和50.0 μg/mL 的四環素、土霉素、美他環素標準溶液和2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL 和100.0 μg/mL 的金霉素標準溶液。使用甲醇將內標物地塞米松配制成1 mg/mL 的貯備液，向地塞米松貯備液中加入甲醇稀釋至20 μg/mL。

取7支具塞試管，分別加入2 mL牛奶樣品及0.1 mL 20 μg/mL 地塞米松內標溶液，再分別加入不同濃度的四環素、土霉素、美他環素標準液各0.1 mL，以及的不同濃度的金霉素標準溶液0.1 mL，分別加入2 mL 水，混合均勻[3]。

1.3.3 液相色譜-質譜分析條件

流動相為甲醇和水，流速為0.5 mL/min；選用電噴霧離子源（ESI+），噴射電壓4.2 kV；毛細管溫度180 ℃；毛細管電壓30 kV；鞘氣（N2）流速0.75 L/min； 輔 助 氣（N2）流 速0.15 L/min； 掃 描方式為多反應離子監測。采用全掃描一級質譜（FullScanMS）、二級質譜（FullScanMS/MS）測定[4]。

2 結果與分析

2.1 四環素類藥物的電噴霧質譜

基于現有研究資料分析，4 種四環素類藥物的結構組成見圖1，結合4 種四環素藥物的分子結構，進行試驗檢測。經過儀器分析，準分子離子峰[M+H]+質荷比（m/z）結果為四環素為445.4，土霉素為461.2，金霉素為478.9，美他環素為443.2。選擇[M+H]+峰進行二級全掃描質譜（MS/MS）分析，產生的碎片離子基峰m/z結果為四環素為427.0，土霉素為443.0，金霉素為461.3，美他環素為426.1。四環素、土霉素及金霉素產生的[M+H-18]+碎片離子為分子脫H2O 形成，但美他環素中的[M+H-17]+碎片離子是分子脫NH3后形成。內標物地塞米松的準分子離子峰m/z為473，其二級質譜m/z為435。

圖1 4 種四環素類藥物的分子結構

2.2 方法的專屬性、線性范圍及檢測限

將空白牛奶和分別添加1 μg/mL 的土霉素（TC）、四環素（OTC）、金霉素（CTC）和美他環素（MTC）的空白牛奶進行全掃描一級質譜（FullScanMS）、二級質譜（FullScanMS/MS）測定，最終檢出結果如圖2 所示。基于檢測結果分析，牛奶中的內源性物質對四環素類藥物的檢測不存在影響，不會影響檢測結果的精確度。經過線性回歸分析，在0.1 ～5.0 μg/mL，四環素標準曲線為y=0.631 9x+0.259 6，r=0.998 3；土霉素標準曲線為y=0.510 3x+0.079 5，r=0.993 9；美他環素的標準曲線為y=0.703 1x+0.203 3，r=0.992 4。在0.2 ～10.0 μg/mL 內，金 霉 素 標 準 曲 線 為y=0.303 9x+0.137 6，r=0.994 9。本實驗采用的檢測方法對牛奶中四環素類的檢出限分別為四環素、土霉素、美他環素均為0.05 μg/mL，金霉素為0.1 μg/mL。

圖2 四環素類藥物的選擇性反應監測色譜圖

2.3 回收率和精密度實驗

為了研究本次分析實驗采用的分析方法對牛奶樣品中4 種四環素類藥物的實際檢測效果，向牛奶樣品中分別添加1 μg/mL 的4 種四環素類藥物標準品1 mL，經過檢測分析，四環素類藥物的平均回收率為四環素98.1%、土霉素95.2%、金霉素88.3%和美他環素86.9%。

以相對標準差結果表示精密度，實驗過程中分別向2 mL 牛奶樣品中添加1 μg/mL 四環素類混合標準溶液1 mL，測定的相對標準偏差為四環素12.2%、土霉素12.8%、金霉素3.2%和美他環素15.0%（n=5）。

3 討論

在實驗檢測過程中，正離子檢測方式下土霉素、四環素及金霉素的質譜斷裂方式相似，存在共同點，即在MS2質譜都優先失去H2O，獲得[M+H-H2O]+，在MS3時再進一步丟失NH3，形成[M+H-H2O-NH3]+的碎片離子。但四環素類藥物中美他環素質譜斷裂規律存在差異，其在MS2時未產生脫水的碎片離子，而是從分子中脫去一個氨分子，產生[M+H-NH3]+離子。從結構來看，美他環素與四環素、金霉素、土霉素存在的主要區別是其在6 位碳原子上沒有羥基，而質譜碎片的主要區別是不能產生脫水碎片離子。因此，經過本次檢測實驗分析，雖然四環素類藥物中存在多個羧基，但其是通過脫掉6-羥基才形成MS2的脫水碎片離子。此外，要想充分測定食品中的四環素類藥物殘留情況，科學處理檢測樣品也同樣重要，以牛奶為例，通常會采用基質固相分散（Matrix Solid-Phase Dispersion，MSPD）法、McIlvaine-EDTA 緩沖液稀釋提取法等進行處理，在處理過程中為保證檢測效果需對C18柱進行凈化處理，需嚴格遵守相關要求進行操作[5]。

4 結論

綜上所述，本文通過應用高效液相色譜質譜聯用法開展檢測實驗，對牛奶中殘留的四環素類藥物進行檢測，結合檢測結果，更為全面地分析了高效液相色譜質譜聯用法在食品中四環素類藥物殘留檢測中的應用，并分析出食品中四環素類藥物殘留檢測需要注意的事項，希望通過本文研究，為高效液相色譜與質譜聯用法的推廣應用及進一步發展提供支持。