高產(chǎn)L-蘇氨酸的缺陷型大腸桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究

張昱陽(yáng)，朱紅薇，楊 洋，袁 成，朱長(zhǎng)俊

（嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314000）

蘇氨酸（Threonine）是人體和動(dòng)物必需的8 種氨基酸之一，有改善機(jī)體免疫、促進(jìn)人體及禽畜生長(zhǎng)等功能。被廣泛用于醫(yī)藥、食品強(qiáng)化劑和飼料添加劑等方面[1-2]。目前，蘇氨酸主要通過(guò)大腸桿菌等微生物發(fā)酵制備[3]。通過(guò)對(duì)高產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化，可有效提高L-蘇氨酸產(chǎn)量[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉湯培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基、大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基，具體配方見(jiàn)文獻(xiàn)[5]；經(jīng)過(guò)育選的賴氨酸、甲硫氨酸缺陷型大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)室保存。L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.63×10-4mol/L）；四氯對(duì)苯醌乙醇溶液（3.0×10-3mol/L）；硼砂溶液（0.1 mol/L）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1100 紫外分光光度計(jì)，SBA1243 電子分析天平；Eppendorf 5810R 離心機(jī)。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)流程如圖1 所示。

圖1 試驗(yàn)流程圖

1.3.1 菌種活化及菌懸液制備

實(shí)驗(yàn)室保存菌株活化，擴(kuò)大培養(yǎng)。無(wú)菌生理鹽水制備成菌懸液，稀釋至108～109CFU/mL。

1.3.2 L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

取0.5 g/L 的L- 蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成4 μg/mL、8 μg/mL、12 μg/mL、16 μg/mL、20 μg/mL、24 μg/mL 和28 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1.0 mL不同濃度的L-蘇氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 容量瓶中，加0.5 mL 硼砂溶液（0.1 mol/L）和1.5 mL 四氯苯醌溶液（3.0×10-3mol/L），定容；50 ℃水浴40 min，冷卻至室溫；以相同方法制備試劑空白為參比，在λ=352 nm 處測(cè)其吸光度，重復(fù)3 次[6]。

1.3.3 發(fā)酵液中L-蘇氨酸含量測(cè)定

發(fā)酵液4 000 r/min 離心20 min，保留上清液并稀釋至500 倍，測(cè)定稀釋液中L-蘇氨酸含量。根據(jù)L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線求不同發(fā)酵液中L-蘇氨酸的含量[7]。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

參考賴慧彪等[8]的研究結(jié)果，原培養(yǎng)基成分葡萄糖、玉米漿及硫酸銨對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響相對(duì)較大，其他組分相對(duì)含量較少且影響較小。設(shè)置不同葡萄糖含量（20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L 和60 g/L）、玉米漿含量（5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L 和25 g/L）、硫酸銨含量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L 和50 g/L）進(jìn)行單因素試驗(yàn)確定因素范圍，使用Design Expert軟件，進(jìn)行3 因子和3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

以5%的接種量吸取1 mL 的賴氨酸缺陷型大腸桿菌菌懸液，接入20 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液中，每組3 瓶，37 ℃搖床培養(yǎng)48 h；測(cè)定每組的L-蘇氨酸含量，進(jìn)行響應(yīng)面分析得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)基方案[9]。

1.3.5 搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化

裝液量以10 mL、15 mL、20 mL、25 mL 和30 mL分組；接種量以1%、3%、5%、7%和9%分組；搖床溫度以31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃和43 ℃分組；搖床轉(zhuǎn)速以140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min和220 r/min 分組。恒溫培養(yǎng)，測(cè)定L-蘇氨酸產(chǎn)量，確定最優(yōu)方案，大致過(guò)程同L-蘇氨酸含量測(cè)定[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

L-蘇氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.062x-0.048 4，R2為0.993 7，擬合度較高，據(jù)此計(jì)算后續(xù)L-蘇氨酸產(chǎn)量較為準(zhǔn)確。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2為培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果。葡萄糖含量為40 g/L 時(shí)出現(xiàn)L-蘇氨酸產(chǎn)量峰值，即取30 g/L、40 g/L、50 g/L 為葡萄糖因素的3 水平（模型A）；玉米漿含量為10 g/L 時(shí)出現(xiàn)L-蘇氨酸產(chǎn)量峰值，即取5 g/L、10 g/L、15 g/L為玉米漿因素的3水平（模型B）；硫酸銨含量為20 g/L 時(shí)出現(xiàn)L-蘇氨酸產(chǎn)量峰值，即取10 g/L、20 g/L、30 g/L 為玉米漿因素的3 水平（模型C）。

圖2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平，通過(guò)軟件得出17 種不同發(fā)酵培養(yǎng)基組合，其回歸方程為Y=5.39+0.13A+0.17B+0.080C-0.047AB+0.14AC-0.25BC-0.89A2-0.31B2-0.34C2。由表1 可知，模型的P＜0.000 1，表明試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的二次多元模型顯著，結(jié)果較為可靠。失擬項(xiàng)為0.178 5 ＞0.05，不顯著，說(shuō)明其他未知因素對(duì)試驗(yàn)影響較小。決定系數(shù)R2為0.990 3，調(diào)整系數(shù)為0.977 9，兩者相差小于0.2，說(shuō)明試驗(yàn)設(shè)計(jì)恰當(dāng)，所得模型有效，且所得結(jié)果可用來(lái)推測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組分。

表1 回歸模型的方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

葡萄糖、玉米漿和硫酸銨之間的響應(yīng)面圖及等高線圖更能反映出每種因素相互之前的作用對(duì)L-蘇氨酸產(chǎn)量的影響。由圖3 可知，玉米漿和硫酸銨等高線顏色變化最快，曲線更為彎曲，說(shuō)明玉米漿和硫酸銨的相互作用較葡萄糖和玉米漿、葡萄糖和硫酸銨來(lái)說(shuō)更顯著。

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)基組分響應(yīng)面和等高線圖

軟件分析得出發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、玉米漿及硫酸銨最佳的配比量為41.0 g/L、11.0 g/L、20.0 g/L。即最終優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖4.1%、玉米漿1.1%、硫酸銨2.0%、K2HPO40.01%、MgSO4·7H2O 0.005%、FeSO4·7H2O 0.001%以及MnSO4·H2O 0.001%，pH 為7.0 ～7.2。

2.3 搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為20 mL、接種量為5%、搖床溫度為37 ℃以及搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)產(chǎn)出的L-蘇氨酸最多，搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果

2.4 最終優(yōu)化后發(fā)酵液中L-蘇氨酸產(chǎn)量測(cè)定

最后對(duì)比優(yōu)化和未優(yōu)化發(fā)酵工藝下不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量，由表2 可知，L-蘇氨酸的產(chǎn)量大幅提升，與胡丹等[11]工藝優(yōu)化后的L-蘇氨酸產(chǎn)量（2.06 g/L）相比也具有顯著優(yōu)勢(shì)。

表2 使用優(yōu)化工藝和未使用優(yōu)化工藝的L-蘇氨酸產(chǎn)量對(duì)比

3 結(jié)論與討論

在發(fā)酵培養(yǎng)基、搖瓶工藝優(yōu)化條件下可有效提高L-蘇氨酸的產(chǎn)量。賴氨酸缺陷型菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量為5.90 g/L，與優(yōu)化前（4.06 g/L）相比產(chǎn)率提高45.32%，甲硫氨酸缺陷型菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量為5.76 g/L，比優(yōu)化前相比（3.89 g/L）產(chǎn)率提高48.07%。筆者接下來(lái)除優(yōu)化培養(yǎng)基的配比外，還可以探索是否有更適合的碳源、氮源，添加其他生長(zhǎng)因子、微量元素是否可以促進(jìn)發(fā)酵。生產(chǎn)L-蘇氨酸的代謝途徑中存在著反饋抑制，是否可通過(guò)對(duì)反饋抑制進(jìn)一步調(diào)控提高發(fā)酵效率。