江淮部分地區麥田日本看麥娘對精噁唑禾草靈的抗性及其交互抗性

許錦程，畢亞玲，李君君，戴魏真，許孟桃，谷承文

(1.安徽科技學院資源與環境學院，安徽鳳陽 233100；2.安徽科技學院農學院，安徽鳳陽 233100)

隨著除草劑使用面積的大幅度增加，雜草抗性問題已成為其高效應用的阻礙。化學除草劑長期施用導致抗性雜草的數量快速上升[1]。截至目前，共有263種雜草(雙子葉植物152種，單子葉植物111種)對除草劑產生不同程度抗藥性[2]。精噁唑禾草靈(fenoxaprop-P-ethyl)屬于乙酰輔酶A羧化酶抑制劑(acetyl-coA carboxylase,ACCase)，在我國用藥歷史較長，因其活性高、防效好等優點被廣泛應用于防治日本看麥娘(Alopecurusjaponicus)[3-5]。其主要通過抑制丙二酰輔酶和ADP的形成從而發揮作用，使植物無法正常合成所需的脂肪酸，導致日本看麥娘死亡[6]。但郭 峰[7]于2011年報道，采自河南、江蘇、山東等地的日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈已產生不同程度的抗藥性，抗性指數高達35.64；畢亞玲等[3]在2015年報道，采自安徽省定遠縣的日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性指數達33.82。抗性日本看麥娘等禾本科雜草的大面積發生，現已成為威脅小麥高產、穩產的重要阻礙。

目前，關于雜草抗性的研究主要集中在靶標抗性(TSR)和非靶標抗性(NTSR)兩方面。徐洪樂[8]在2015年證實，基因表達量差異是導致日本看麥娘產生靶標抗性的原因之一；趙 寧[9]在2019年發現，乙酰乳酸合成酶基因1 781位突變是導致日本看麥娘對精噁唑禾草靈產生抗性的重要原因。非靶標抗性主要包括屏蔽、隔離、代謝三種作用方式，其中除草劑的代謝作用較廣泛，所涉及的代謝酶類主要為谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferases,GSTs)和細胞色素P450氧化酶等，其能夠在機體受到有毒物質威脅時，將有毒物質代謝掉，保護細胞免受傷害，在許多生物體內擔任解毒系統角色[10]；因其能夠參與調節雜草內部的解毒代謝活性，所以其代謝能力增強目前被認為是高等植物對除草劑產生非靶標抗性的主要原因[11]。

江淮地區是我國重要的小麥產區之一，日本看麥娘等禾本科雜草在小麥田的發生較為嚴重[12]。而目前關于雜草抗性的研究多集中在靶標抗性和抗性檢測方面[13-17]。基于此，本試驗采集江淮部分地區日本看麥娘種群，測定其對精噁唑禾草靈的抗性水平及部分種群的ACCase基因，將GSTs酶抑制劑滅草環、三聚氯氰、NBD-Cl和P450s酶抑制劑PBO、馬拉硫磷與精噁唑禾草靈聯合作用，以探尋日本看麥娘可能存在的靶標抗性機制和GSTs、P450s代謝酶抑制劑對精噁唑禾草靈的作用；并測定抗精噁唑禾草靈種群對8種不同類型除草劑的抗性，為該麥區科學防除抗性日本看麥娘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試種群

供試日本看麥娘種群種子于2019-2020年采自江淮部分地區麥田，以未施用除草劑的非耕地田塊種子為對照，具體種群信息如表 1，種子晾曬風干后置于0～5 ℃冷藏庫中保存待用。

表1 不同日本看麥娘種群信息

1.1.2 供試藥劑

除草劑：69 g·L-1精噁唑禾草靈水乳劑(fenoxaprop-P-ethyl)，拜耳作物科學(中國)有限公司；108 g·L-1高效氟吡甲禾靈乳油(haloxyfop-R-methyl)，山東湯普樂作物科學有限公司；15%炔草酯可濕性粉劑(clodinafop-propargyl)，浙江天豐生物科學有限責任公司；5%唑啉草酯乳油(pinoxaden)，瑞士先正達作物保護有限公司；12.5%烯禾啶乳油(sethoxydim)，中農立華(天津)農用化學品有限公司；30 g·L-1甲基二磺隆油懸浮劑(mesosulfuron-methyl)，拜耳作物科學(中國)有限公司；7.5%啶磺草胺水分散粒劑(pyroxsulam)，科迪華農業科技有限責任公司；70%氟唑磺隆水分散粒劑(flucarbazone-sodium)，浙江天一生物科技有限公司；50%異丙隆可濕性粉劑(isoproturon)，江蘇快達農化股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 日本看麥娘培養

選擇飽滿度相同的日本看麥娘種子，用75%酒精對種子進行消毒3～5 min，再用蒸餾水清洗種子三次；置于已滅菌的培養皿中，于GXZ型光照智能培養箱培養(光/暗): 12 h/12 h; 溫度：24 ℃/20 ℃)；待種子催芽露白(3 d)之后，均勻播入含有營養混合土(砂土∶基質=1∶1，總養分含量63%)的直徑為12 cm塑料盆中，每盆15顆，覆土0.5 cm以蓋住種子，吸透水后置于溫室內(光/暗): 16 h/8 h; 溫度：25 ℃; 相對濕度60%～75%)培養。定期觀察日本看麥娘的生長情況，當日本看麥娘長至一葉一心期，剔除過大和過小幼苗，定苗至每盆10株。

1.2.2 不同日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性水平測定

采用整株水平生物測定法，參照《農藥室內生物測定試驗準則》NY/T 1155.4-2006進行[18]。根據預試驗設計劑量，麥田種群劑量為0、15.0、45.0、135.0、405.0和1 215.0 g(a.i.)·hm-2，對照種群劑量為0、1.7、5.0、15.0、45.0和135.0 g(a.i.)·hm-2。不同種群共設6個處理，每處理3次重復。藥劑的配制使用母液稀釋梯度法，用0.1%的吐溫-80水溶液稀釋定容配制成母液，以0.1%吐溫-80水溶液(不含藥劑)做空白對照[19]。待日本看麥娘長至3葉1心，使用HCL-2000行走式噴霧塔對日本看麥娘精準噴霧，噴液壓力40 psi，扇形噴頭，噴液量450 L·hm-2，噴液面距離日本看麥娘頂端葉片50 cm[20]。施藥后置于日光溫室內繼續培養，溫、濕度管理同上。藥后21 d剪取日本看麥娘地上部分，稱量鮮重，計算鮮重抑制率(對照地上部分鮮重-各處理地上部分鮮重)/對照地上部分鮮重×100%)；以試驗劑量對數值(x)與鮮重抑制率幾率值(y)擬合毒力回歸方程(y=a+bx)，計算GR50值及95%置信限；計算抗性指數(resistance index,RI抗性種群GR50/敏感種群GR50)。雜草抗性分級標準如下，中抗性：RI≤10.00；高抗RI>10.00[2]。

1.2.3 不同抗性日本看麥娘種群ACCase基因差異檢測

從各地區中各選取一個高抗、中抗種群和敏感種群進行測定。日本看麥娘培養至3葉1心時，剪取植株幼嫩葉片組織，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。DNA的提取采用CTAB法[21]。使用已報道的ACCase基因序列(JQ068820.1)設計引物[22]，擴增引物為FP : 5′-TTTCCCAGCGGCAGACAGAT-3′，RP : 5′-TCCCTGGAGT- CTTGCTTTCA- 3′，瓊脂糖凝膠電泳后，將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，對測序結果進行分析。擴增的區域包含已證實的ACCase CT區域發生突變的7個位點[3]。

1.2.4 GSTs、P450s酶抑制劑對精噁唑禾草靈的效應測定

供試種群同1.2.3，待日本看麥娘長至3葉1心，分別噴施滅草環150 g(a.i.)·hm-2、三聚氯氰180 g(a.i.)·hm-2、NBD-Cl 270 g(a.i.)·hm-2、PBO 4 200 g(a.i.)·hm-2、馬拉硫磷 1 000 g(a.i.)·hm-2，待葉片上霧滴晾干(約 1 h)，噴施不同劑量精噁唑禾草靈，噴施劑量同 1.2.2，以單獨施用精噁唑禾草靈對照，不同處理三次重復。藥后28 d計算施用酶抑制劑后的GR50和各參數，按下式計算增效倍數。

增效倍數(SR)=單劑的GR50/(酶抑制劑+單劑)的GR50

1.2.5 抗精噁唑禾草靈種群對其他除草劑的抗性測定

為明確抗性種群對不同類型除草劑的抗性，選取8種小麥田除草劑進行試驗，方法同1.2.2，試驗劑量見表2。

表2 供試除草劑及測定劑量

1.3 數據分析

使用DPS 7.05對數據進行整理和分析。

2 結果與分析

2.1 日本看麥娘對精噁唑禾草靈的抗性分析

由表3可見，供試日本看麥娘各種群均對精噁唑禾草靈產生了不同程度的抗性。對照AH-7對精噁唑禾草靈較敏感，GR50值為25.21 g(a.i.)·hm-2。安徽省供試種群AH-40、AH-42、AH-43、AH-44均達到高抗水平，抗性指數分別為18.54、14.90、14.68、 14.12，占種群總數的40%；其中，采自安徽省淮南市鳳臺縣夏集鎮的種群AH-40的GR50值最高，為467.28 g(a.i.)·hm-2，是其大田推薦劑量62.1 g(a.i.)·hm-2的7.5倍。江蘇省供試日本看麥娘種群僅有JS-19達到高抗水平，占供試種群總數的10%，其他均為中抗，但其GR50仍高于該藥劑的推薦劑量。供試日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性為：AH-40>AH-42>AH-43>AH-44>JS-19>JS-21>JS-20>JS-18>AH-41(表3)。

表3 日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性水平

2.2 抗性日本看麥娘ACCase基因分析

對日本看麥娘敏感種群AH-7、抗性種群AH-40、AH-41、JS-19、JS-20進行ACCase基因擴增序列(JQ068820. 1)同源性均達95.8%以上，確定擴增序列為日本看麥娘ACCase基因序列。將測序結果與日本看麥娘(A.japonicus)的ACCase基因序列進行比對，供試種群在可引起靶標抗性的位點處均未發現突變。

2.3 GSTs、P450s代謝酶抑制劑對精噁唑禾草靈的效應

如表4所示，噴施GSTs酶抑制劑后，敏感種群AH-7對精噁唑禾草靈的敏感性略有增加；抗性種群AH-40、JS-19 對精噁唑禾草靈的GR50值均下降，其中，NBD-Cl能顯著降低抗性種群AH-40對精噁唑禾草靈的抗性，增效倍數達2.45；而抗性種群AH-41、JS-20對精噁唑禾草靈的GR50并未有下降的趨勢，表明GSTs酶抑制劑未對其產生增效作用。由表5可知，施用2種P450s酶抑制劑后，AH-40種群對精噁唑禾草靈的GR50有所下降，增效倍數為1.64～2.03，表明P450s酶抑制劑對該種群具有增效作用；而AH-41、JS-19、JS-20在施用P450s酶抑制劑后，并未產生增效作用。結果顯示，施用代謝酶抑制滅草環、三聚氯氰、NBD-Cl、PBO、馬拉硫磷后，抗性種群AH-40對精噁唑禾草靈的GR50均有所下降；施用滅草環、三聚氯氰、NBD-Cl后，抗性種群JS-19對精噁唑禾草靈的GR50有所下降。供試酶抑制劑對其他抗性種群未產生明顯增效作用。

表4 添加GSTs酶抑制劑后對日本看麥娘各種群的劑量反應曲線參數比較

表5 添加P450s酶抑制劑后對日本看麥娘各種群的劑量反應曲線參數比較

2.4 抗精噁唑禾草靈種群對其他除草劑的抗性

由表6可知，抗性種群AH-40對炔草酯、甲基二磺隆表現為高抗，抗性指數為14.67、19.91，對其他供試藥劑均表現為中抗，對唑啉草酯、啶磺草胺、異丙隆敏感，抗性指數在0.59～2.09之間。AH-41對高效氟吡甲禾靈、炔草酯、甲基二磺隆表現高抗，抗性指數分別為 16.40、18.93、28.84，而對其余藥劑中抗。JS-19對高效氟吡甲禾靈、炔草酯、甲基二磺隆高抗，抗性指數分別為 50.32、19.37、 28.42，對唑啉草酯、啶磺草胺、異丙隆敏感。JS-20對炔草酯、烯禾啶、甲基二磺隆表現為高抗，而對啶磺草胺、異丙隆較為敏感。綜上所述，4個抗性種群均對炔草酯、AH-41和JS-19對高效氟吡甲禾靈、JS-20對烯禾定均有高水平抗性，其他抗性種群對各藥劑的抗性水平均在中等抗性水平范疇。此外，4個供試抗性種群均對甲基二磺隆高抗，但均對唑啉草酯、啶磺草胺、氟唑磺隆、異丙隆較為敏感，可作為江淮地區防除抗性日本看麥娘的替代藥劑。

表6 抗性種群對8種除草劑的抗性

3 討 論

日本看麥娘是江淮地區冬小麥田的惡性雜草之一，黃紅娟等[23]、高興祥等[24]通過調查長江中下游與黃淮海地區小麥田雜草群落發現，日本看麥娘在優勢度比較中均排在前列，嚴重影響著該地區小麥的高質量生產。本研究通過測定采自江淮地區的日本看麥娘種群對精噁唑禾草靈的抗性水平發現，供試種群均對精噁唑禾草靈產生了不同程度的抗性，產生高水平抗性的種群數量占種群總數的50%，抗性指數最高達18.54，這與趙 寧等[9]的研究結果略有不同，可能與采集地點有關系。造成日本看麥娘對精噁唑禾草靈產生抗藥性的原因與當地經濟發展水平、用藥習慣、單一藥劑的使用年限和耕作制度等因素均有關系。

相較于靶標抗性，雜草非靶標抗性的不確定因素較多，而代謝抗性能力增強目前被認為是植物由體內的P450s、GSTs等酶協同作用，將除草劑代謝為低毒物質等引起的。葛魯安等[25]研究證明，雜草的代謝能力與P450s、GSTs酶活性有關，使其產生非靶標抗性。本研究結果表明，供試種群AH-40、JS-19在施用GSTs酶抑制劑后，對精噁唑禾草靈的GR50均有很大程度下降，表明GSTs酶抑制劑對該種群具有增效作用；施用P450s酶抑制劑后，AH-40種群對精噁唑禾草靈的的GR50有所下降，增效倍數為1.64～2.03倍。

綜合試驗結果，表明酶抑制劑對精噁唑禾草靈有增效作用，但精噁唑禾草靈在日本看麥娘體內的具體增效機制還需進一步研究。

雜草體內物質代謝是十分復雜的過程，需要多種酶和器官同時參與，導致其對除草劑產生不同程度的抗性[26]。徐洪樂等[8]研究發現，抗精噁唑禾草靈的日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈、炔草酯等藥劑均已產生抗性；而相關試驗研究表明，日本看麥娘易對作用機制相同的除草劑產生抗性，產生原因與化學結構簡單及對不良環境的適應等因素有關[7,27]。本研究通過測定抗性日本看麥娘的抗性發現，4個抗性種群均對炔草酯和甲基二磺隆、AH-41和JS-19對高效氟吡甲禾靈、JS-20對烯禾啶產生了高水平抗性，但對唑啉草酯、啶磺草胺、氟唑磺隆和異丙隆較為敏感，其可作為江淮地區防除抗性日本看麥娘的替代藥劑。