基于網絡藥理學方法探討芍藥甘草湯治療高催乳素血癥的潛在作用機制Δ

時萌萌，蔡華丹，馬 良，周 坤，付永莉，劉 茜，顧洪偉#

(1.武漢市精神衛生中心/武漢市心理醫院藥學部，武漢 430000； 2.中國人民解放軍總醫院第五醫學中心藥學部，北京 100039)

服用抗精神病藥的患者中，高催乳素血癥(hyperprolactinemia，HPRL)發生率高達70%[1]。該病可導致性功能障礙、骨密度降低、月經紊亂、乳房發育和溢乳，以及下丘腦-垂體-性腺軸的抑制，還可能使乳腺癌的發生率升高。目前，針對藥源性HPRL尚無安全有效的治療方法，中醫認為肝脾腎三臟功能失調導致氣血失和為HPRL的基本病機，故中醫多從腎、肝、脾三臟著手治療[2]。芍藥甘草湯始載于《傷寒論》，方中芍藥味酸、苦、甘，入肝脾二經，具有養血斂陰、柔肝止痛的功效；甘草味甘、性平，歸心、肺、脾、腎經，具有補中益氣、緩急止痛及調和藥性的功效。研究結果證實，芍藥甘草湯可治療HPRL，但尚不明確其作用機制[3-4]。網絡藥理學作為新興的技術方法能對中藥作用于機體后的多成分、多途徑和多靶點進行較為全面地揭示。故本研究采用網絡藥理學方法，分析、預測芍藥甘草湯治療HPRL的活性成分和作用靶點，以期為后續的基礎研究提供科學依據和啟示。

1 資料與方法

1.1 芍藥甘草湯活性成分及作用靶點的獲取

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)數據庫中，以白芍、甘草為關鍵詞，以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為篩選條件進行檢索，檢索出芍藥甘草湯的活性成分。再次利用TCMSP檢索白芍和甘草所有活性成分對應的靶點，在Uniprot數據庫中獲取靶點對應的靶基因，即芍藥甘草湯活性成分作用的靶點。

1.2 HPRL疾病靶點的獲取

以“HPRL”和“Hyperprolactinaemia”為關鍵詞，分別通過GeneCards數據庫、人類孟德爾遺傳綜合數據庫(OMIM)數據庫、DisGeNET數據庫和Drugbank數據庫檢索并篩選HPRL相關的靶點。

1.3 藥物-疾病靶點取交集

為明確芍藥甘草湯與HPRL潛在靶點間的相互作用，利用Venny 2.1在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取交集靶點，作為芍藥甘草湯治療HPRL的重要靶點。

1.4 芍藥甘草湯成分-HPRL靶點的蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

把得到的交集靶點上傳至STRING 11.0數據庫(https://string-db.org/)，將物種設置為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設置為0.4，去除游離的節點，獲得PPI網絡，并通過Cytoscape 3.7.1軟件根據節點度值大小篩選核心靶點。

1.5 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建

運用Cytoscape 3.7.1創建藥物-成分-靶點-疾病網絡，并利用Network Analyzer插件對點度中心性(DC)、中介中心性(BC)和接近中心性(CC)網絡拓撲參數進行分析，判斷核心靶點和主要活性成分。

1.6 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

在DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)中導入藥物與疾病的交集靶點，設置P<0.01，對主要的生物學過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)與代謝通路進行富集分析，按Pvalue升序進行排序，利用微生信軟件(http://www.bioinformatics.com.cn/)將通路進行可視化，以柱狀圖和氣泡圖形式繪制結果。

1.7 芍藥甘草湯活性成分和核心靶點分子對接

從PubChem數據庫中下載芍藥甘草湯活性成分SDF結構，靶蛋白三維結構從PDB數據庫下載獲得，使用AutodockTools 1.5.6打開配體小分子和靶蛋白，對其進行加氫、計算電荷、合并非極性氫后，采用Autodock vina 1.1.2進行半柔性對接，分析結合能力。

2 結果

2.1 芍藥甘草湯活性成分和作用靶點

以OB≥30%且DL≥0.18為篩選條件，通過TCMSP數據庫篩選得到白芍活性成分13種，甘草活性成分92種，重復成分3種，共102種活性成分。同時，刪除重復靶點后獲得白芍和甘草活性成分對應靶點244個。白芍和甘草部分活性成分基本信息見表1(僅列出其中20項)。

表1 芍藥甘草湯部分活性成分Tab 1 Some active ingredients of Shaoyao Gancao decoction

2.2 HPRL疾病靶點

通過檢索GeneCards、DisGeNET數據庫，分別得到113、48個疾病靶點，以OMIM和DrugBank數據庫作為補充，整合并刪除重復靶點，最終獲取HPRL疾病靶點144個。

2.3 藥物與疾病靶點取交集

在Venny 2.1在線工具中輸入芍藥甘草湯靶點和HPRL相關靶點繪制韋恩圖，共取得藥物-疾病交集靶點35個，見圖1。

圖1 芍藥甘草湯-HPRL共同靶點韋恩圖Fig 1 Venny diagram of the common targets of Shaoyao Gancao decoction-HPRL

2.4 芍藥甘草湯成分-HPRL靶點PPI網絡的構建

通過STRING 11.0數據庫導入韋恩圖獲得的35個交集靶點，得到芍藥甘草湯-HPRL的PPI網絡，見圖2。該網絡共有35個節點，183條邊，平均節點度值為10.5，度值排序居前10位的靶點為FOS、雌激素受體1(ESR1)、表皮生長因子(EGF)、受體酪氨酸蛋白激酶2(ERBB2)、G1/S-特異性Cyclin-D1(CCND1)、JUN、孕酮受體(PGR)和白細胞介素(IL)4，上述靶點可能是芍藥甘草湯治療HPRL的關鍵靶點。

圖2 芍藥甘草湯-HPRL靶點PPI網絡Fig 2 PPI network diagram of Shaoyao Gancao decoction-HPRL

2.5 藥物-成分-靶點-疾病網絡的構建

在Cytoscape 3.7.1軟件上，構建“藥物-成分-靶點-疾病”關系網絡，見圖3；圖中，箭頭表示疾病，三角形表示藥物，菱形表示預測靶點，圓形和六邊形表示活性成分，八邊形表示共有活性成分。利用Network Analyzer分析網絡的拓撲參數，以大于DC、BC和CC的平均值為標準篩選出ESR1、α1B-腎上腺素受體(ADRA1B)和血管內皮生長因子受體2(KDR)等核心靶點，槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、芒柄花黃素(formononetin)、甘草查爾酮A(licochalcone a)和柚皮素(naringenin)等關鍵有效成分，見表2—3。

圖3 芍藥甘草湯-成分-靶點-HPRL網絡圖Fig 3 Network diagram of Shaoyao Gancao decoction-ingredient-target-HPRL

表2 芍藥甘草湯治療HPRL核心靶點拓撲參數Tab 2 Topological parameters of core targets of Shaoyao Gancao decoction in the treatment of HPRL

表3 芍藥甘草湯治療HPRL關鍵成分拓撲參數Tab 3 Topological parameters of key ingredients of Shaoyao Gancao decoction in the treatment of HPRL

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過GO富集分析共獲取GO條目112個(P<0.05)，其中BP條目82個，CC條目10個，MF條目20個，根據P值大小，可視化分析前10條GO條目，見圖4。結果顯示，芍藥甘草湯主要參與的BP包括藥物反應、老化、DNA模板轉錄的正調控、從RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、胞外信號調節激酶(ERK)1和ERK2級聯的正調控、一氧化氮生物合成過程的正調控以及對乙醇的反應等；涉及的CC主要包括線粒體外膜、軸突、質膜的組成部分、核和內質網等；涉及蛋白質異二聚活性、酶結合、相同的蛋白質結合、轉錄因子結合、受體信號蛋白酪氨酸激酶活性等MF。

圖4 GO功能富集分析柱狀圖Fig 4 Histogram of GO enrichment analysis

KEGG富集分析得到信號通路40條(P<0.05)，分為疾病通路24條，包括各類癌癥、肺結核、肝炎和類風濕關節炎等；其他通路16條，包括FoxO、缺氧誘導因子(HIF)1、JAK激酶-信號轉導與轉錄激活子(Jak-STAT)、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、催乳素(PRL)信號通路和T細胞受體信號通路等，P值由小到大排序居前25位通路的氣泡圖見圖5。

圖5 KEGG通路富集氣泡圖Fig 5 Enrichment bubble diagram of KEGG pathway

2.7 分子對接結果

以“2.5”項下篩選出來的11個活性化合物分別與核心靶蛋白進行分子對接驗證，見圖6。對接效能排序居前4位的分別為ADRA1B與shinpterocarpin(MOL004891)、ADRA1B與山柰酚(MOL000422)、ADRA1B與甘草查爾酮A(MOL000497)以及KDR與槲皮素(MOL000098) ，其結合能分別為-42.7、-41.9、-39.8和-38.5 kJ/mol。上述結合模式見圖7。

圖6 分子對接效能熱圖Fig 6 Heat map of molecular docking efficiency

圖7 分子對接模式圖Fig 7 Molecular docking mode diagram

3 討論

根據中醫古籍中的記載，HPRL可歸屬為“閉經”“月經后期”“乳泣”“崩漏”“不孕”和“經行乳房脹痛”等范疇，中醫治療主要以疏肝解郁、補腎健脾、化濕祛瘀和回乳通經為主。芍藥甘草湯有疏肝解郁、安脾緩急之功，益氣養血、散瘀通經之效，近年來多項研究結果證實芍藥甘草湯具有降低PRL的效用，但發揮效用的有效成分和作用靶點尚不明確。

本研究共篩選出93種芍藥甘草湯的活性成分，關鍵活性成分包括槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素、甘草查爾酮A和柚皮素等，上述活性成分可能在芍藥甘草湯治療HPRL的過程中發揮重要作用，表明芍藥甘草湯是通過多成分、多靶點、多途徑共同發揮作用的。雌激素可促進腦垂體泌乳細胞的形成，并且刺激其分泌和釋放PRL[5]。植物雌激素作為“選擇性雌激素受體調節劑”可以與ESR1結合，發揮弱的雌激素樣或抗雌激素樣作用[6-7]。槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素和柚皮素均為植物雌激素，當其處于高水平時，可起到抗雌激素的作用，從而降低PRL水平[8-9]。

藥物-成分-靶點-疾病網絡和PPI網絡篩選出ESR1、ADRA1B、KDR、FOS、EGF和ERBB2等多個核心靶點，芍藥甘草湯可能通過上述靶點發揮治療HPRL的作用。下丘腦室旁核(PVN)被認為是PRL調節系統的中樞刺激成分，有實驗結果證明，α1B-腎上腺素能受體亞型(ADRA1B)在PVN水平上調節催乳素具有重要作用[10]。體外研究結果表明，所有的腎上腺素受體拮抗劑對ADRA1B的拮抗作用都會使PRL產生劑量依賴性降低[11]。有研究結果表明，小鼠乳腺肌上皮和上皮中血管內皮生長因子(VEGF)的條件性缺失降低了血管密度和功能，嚴重影響乳汁分泌[12]。KDR可以通過共受體神經纖毛蛋白增強VEGF的作用[13-14]。證明KDR可能參與了PRL的生成過程。本研究結合分子對接技術，進一步驗證了芍藥甘草湯治療HPRL的作用機制，其主要活性成分與核心靶點具有較好的結合能力。

KEGG分析結果表明，芍藥甘草湯可能通過調控FoxO、HIF-1、PRL、Jak-STAT、PI3K-Akt和MAPK等信號通路發揮治療HPRL的作用。有研究結果表明，PRL誘導成纖維細胞、白細胞和大鼠C6神經膠質瘤細胞中神經元型一氧化氮合酶(nNOS)的表達，nNOS產生的一氧化氮可能是大腦中PRL作用的信使，調節PRL和催產素分泌[15]。PRL受體(PRLR)與PRL結合啟動JAK激酶2-信號轉導及轉錄激活因子5(JAK2-STAT5)信號傳導通路[16-17]。高PRL環境下，PRL/PRLR-JAK2-STAT5信號通路相關因子表達降低，與該信號通路相關的激素酶級聯反應降低，抑制性腺軸功能及性激素的產生[18-19]。丁巧燕等[20]的研究結果表明，回乳抑增方可通過調控PI3K-Akt-mTOR信號通路，抑制催乳素腺瘤的增長和PRL的過度分泌；Tang等[21]的研究結果表明，卡麥角林通過抑制AKT-mTOR信號通路誘導催乳素瘤細胞自噬死亡，控制PRL水平；Romano等[22]發現，PI3K-Akt抑制劑可減弱胰島素樣生長因子刺激的催乳素分泌。結合本研究結果可推測，芍藥甘草湯可能通過PI3K-Akt途徑治療HPRL。

本研究以網絡藥理學方法對芍藥甘草湯治療HPRL的作用機制進行探討，預測了芍藥甘草湯治療HPRL的主要成分、作用靶點和信號通路，并以分子對接理論驗證了預測結果的合理性。但本研究是基于目前公開的數據資料，而數據具有實時性，故本研究具有一定的局限性，尚有待基礎和臨床研究的進一步驗證。