基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)研究黃芪-川芎治療脊髓損傷的作用機(jī)制Δ

漆國棟，漆 偉，劉才英，李姝君，江 瓊#

(1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院骨科，重慶 400010； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種具有較高致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重影響患者身心健康，在全球范圍內(nèi)皆具有流行性[1-2]。我國SCI的年患病率高于世界平均水平，達(dá)每百萬人中37人次，且治療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，單次治療費(fèi)用可高達(dá)30余萬元[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要采用多學(xué)科協(xié)同方案治療SCI，包括急性期的神經(jīng)減壓外科治療和亞急性及后期的綜合康復(fù)治療，但總體效果有限[4-5]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論中雖無SCI的病名，但是歷代典籍對(duì)該病的認(rèn)識(shí)頗多，其中《靈樞·寒熱病》中最早記載了相類似的“體惰”?，F(xiàn)代中醫(yī)多認(rèn)為其病位在督脈，督脈阻滯，累及任沖及肝腎、脾胃等，多以活血祛瘀、通督為治療原則[6-7]。黃芪功以益氣固表，川芎為行氣活血要藥，兩藥配伍可共奏益氣行氣、活血化瘀之功效[8]。有研究通過中醫(yī)傳承輔助系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，黃芪、川芎為SCI內(nèi)治處方中選擇頻次居前列的藥物[9-10]。補(bǔ)陽還五湯[11]、脊髓康[12]為治療SCI的經(jīng)典復(fù)方，其中黃芪、川芎皆為方中重要組成部分。課題組在前期實(shí)驗(yàn)研究中已初步明確了黃芪、川芎的主要成分在治療SCI種的作用效果[13-15]。但兩藥配伍的整體作用靶點(diǎn)和機(jī)制尚不明確，鑒于此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，探討黃芪-川芎治療SCI的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 黃芪-川芎的成分及靶點(diǎn)篩選

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp2/)，以口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選黃芪-川芎的成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)以物種為人的原則規(guī)范靶點(diǎn)名稱。

1.2 SCI靶點(diǎn)納入及共同靶點(diǎn)

利用GeneCard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)檢索SCI相關(guān)靶點(diǎn)，檢索詞為“spinal cord injury”，納入標(biāo)準(zhǔn)為相關(guān)度≥10。在VENNY 2.1軟件中分別導(dǎo)入藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的名稱，繪制韋恩圖，獲得共同靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

利用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，研究物種設(shè)定為“Homo sapiens”，設(shè)定高等置信度為0.700，隱藏?zé)o關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)，從而構(gòu)建出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。通過Network Analyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，以?jié)點(diǎn)度值大小進(jìn)行PPI核心靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)。節(jié)點(diǎn)度值代表與該節(jié)點(diǎn)連線的條數(shù)，數(shù)值越大則表明其在網(wǎng)絡(luò)中起到的樞紐作用越重要[16]。

1.4 基因本體(GO)功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

運(yùn)用R 3.6.0軟件和Bioconductor平臺(tái)(https: //www.bioconductor.org/)對(duì)共同靶點(diǎn)以校正P<0.01為設(shè)定條件進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO功能富集分析包括生物學(xué)過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC)。最終以條形圖和氣泡圖形式呈現(xiàn)富集分析結(jié)果。

1.5 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

將黃芪-川芎成分、成分靶點(diǎn)和共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，評(píng)價(jià)方法與PPI網(wǎng)絡(luò)分析相同。

1.6 關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接

通過成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)及相應(yīng)的活性成分，登錄PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmsp-e.com/tcmsp2/)中下載對(duì)應(yīng)活性成分的分子結(jié)構(gòu)。先利用PyMOL 2.5.0及 AutoDock軟件處理蛋白和配體分子，然后通過Vina預(yù)測(cè)分子對(duì)接的結(jié)合能，最后進(jìn)行分子對(duì)接可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-川芎成分及靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)共得到26個(gè)活性成分，其中黃芪的活性成分20個(gè)，川芎的活性成分7個(gè)，葉酸為兩者的重復(fù)成分，見表1。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范靶點(diǎn)名稱，得到藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)97個(gè)。

表1 黃芪-川芎主要活性成分基本信息Tab 1 Main ingredients of astragalus membranaceus-ligusticum Chuanxiong

2.2 SCI靶點(diǎn)及共同靶點(diǎn)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中獲得符合篩選條件的疾病靶點(diǎn)690個(gè)。韋恩圖中間交集為藥物與疾病的共同靶點(diǎn)，共38個(gè)，見圖1。

圖1 藥物與疾病靶點(diǎn)交集韋恩圖Fig 1 Venn diagram of intersection of drugs and disease targets

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

PPI網(wǎng)絡(luò)見圖2，該網(wǎng)絡(luò)共36個(gè)節(jié)點(diǎn)，166條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為8.74。根據(jù)度值篩選出排序居前10位的關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)，見圖3；其中，絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)8、白細(xì)胞介素(IL)6、表皮生長因子受體(EGFR)、MYC和雌激素受體1(ESR1)等5個(gè)靶點(diǎn)的度值均>2倍平均值。

圖3 度值排序居前10位的核心靶點(diǎn)柱狀圖Fig 3 Histogram of the top ten core targets with degree value

2.4 GO功能富集分析

利用R語言對(duì)共同靶點(diǎn)從BP、MF和CC 3個(gè)水平進(jìn)行富集分析，共得到1 076個(gè)GO條目(校正P<0.01)，將顯著性排序居前10位的條目以條形圖形式展示，見圖4。BP共619個(gè)條目，涉及對(duì)類固醇激素的響應(yīng)、對(duì)金屬離子的響應(yīng)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、對(duì)氧化應(yīng)激的響應(yīng)、神經(jīng)元死亡的調(diào)控和活性氧代謝過程的調(diào)控等；MF共35個(gè)條目，主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性、組蛋白去乙?；附Y(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性和半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與細(xì)胞凋亡過程等；CC共13個(gè)條目，主要涉及膜筏、膜區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核染色質(zhì)、髓鞘和細(xì)胞基部等。

A.BP；B.MF；C.CCA.BP；B.MF；C.CC圖4 GO功能富集分析條形圖Fig 4 Go enrichment analysis bar chart

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析共得到88條信號(hào)通路(校正P<0.01)，將顯著性排序居前20位的通路以氣泡圖形式展示，見圖5。主要涉及腫瘤壞死因子(TNF)、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)、MAPK、IL-17和核因子κB(NF-κB)等信號(hào)通路。

圖5 KEGG富集氣泡圖Fig 5 KEGG enrichment bubble diagram

2.6 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖6，該網(wǎng)絡(luò)中共有118個(gè)節(jié)點(diǎn)，288條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值為4.80。圖6中，圓形代表黃芪-川芎作用于SCI，矩形代表黃芪的活性成分，三角形代表川芎的活性成分，長方形代表基因靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，度值排序居前5位的活性成分為槲皮素、山柰酚、7-O-甲基異木糖醇、異鼠李堿和刺芒柄花素。黃芪-川芎作用于SCI的靶基因共38個(gè)，其中PTGS1、F2、HSP90AA1、PPARG和AR的度值均>2倍平均值。度值越大，說明關(guān)聯(lián)數(shù)量越多，因此，可以推測(cè)上述成分和靶點(diǎn)在黃芪-川芎治療SCI中具有重要意義。

2.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接

根據(jù)上述成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，選取活性成分關(guān)聯(lián)最多的共同靶點(diǎn)。PTGS1關(guān)聯(lián)數(shù)量最多，且可同時(shí)連接黃芪活性成分槲皮素、山柰酚和7-O-甲基異木糖醇等，以及川芎有效成分亞油酸乙酯、楊梅酮。PTGS1與黃芪-川芎活性成分分子對(duì)接結(jié)果顯示：槲皮素可以與PTGS1中ARG-120、TYR-385、TYR-355和VAL-523位點(diǎn)形成氫鍵，結(jié)合能為-28.42 kJ/mol；山柰酚在TYR-385、SER-530位點(diǎn)形成氫鍵，結(jié)合能為-27.59 kJ/mol；7-O-甲基異木糖醇在ARG-120、ILE-523和SER-530位點(diǎn)形成氫鍵，結(jié)合能為-26.75 kJ/mol；亞油酸乙酯在ARG-120、TYR-355位點(diǎn)形成氫鍵，結(jié)合能為-31.35 kJ/mol；楊梅酮在TYR-355、TYR-385、ALA-527和SER-530位點(diǎn)形成氫鍵，結(jié)合能為-13.79 kJ/mol。上述結(jié)果表明，各活性成分與PTGS1可良好的結(jié)合，PyMol軟件制作的可視化圖譜詳細(xì)展示了分子對(duì)接情況，見圖7。

3 討論

SCI屬于中醫(yī)“體惰”“痿證”和“痹證”范疇，針對(duì)其病機(jī)特點(diǎn)，多采用三期辨證法，早期宜活血化瘀，中期多攻補(bǔ)兼施，晚期偏滋補(bǔ)腎脾[17]。黃芪為補(bǔ)氣名藥，川芎為“血中之氣藥”，兩藥配伍作為主要組成的最經(jīng)典復(fù)方莫過于三期辨證中皆可加減應(yīng)用的補(bǔ)陽還五湯。一項(xiàng)納入26個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的循證研究結(jié)果表明，中藥治療SCI有效且安全，其中補(bǔ)陽還五湯是最常用的復(fù)方，黃芪是最常用的單味藥[18]。

本研究首先構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，分析結(jié)果表明，MAPK8、IL-6、EGFR、MYC和ESR1等5個(gè)靶點(diǎn)度值>2倍平均值，說明其可能為黃芪-川芎作用于SCI的核心靶點(diǎn)。檢索相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，MAPK8是MAP激酶家族的成員，為多個(gè)生化信號(hào)的整合點(diǎn)，調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路，在治療SCI中可參與改善神經(jīng)炎癥、減輕細(xì)胞凋亡等過程[19]。IL-6是一種分泌蛋白，能刺激B細(xì)

胞產(chǎn)生抗體從多種途徑刺激細(xì)胞，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)蛋白的合成，在脊髓損傷后引發(fā)的炎癥反應(yīng)中起到重要作用[20-21]。EGFR是上皮生長因子細(xì)胞增殖和信號(hào)傳導(dǎo)的受體，有證據(jù)表明其可促進(jìn)SCI損傷區(qū)域神經(jīng)元的生成[22]。MYC和ESR1都屬于作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，可通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和增殖。研究結(jié)果表明，發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，MYC可能通過促進(jìn)軸突再生和生長，幫助修復(fù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞[23]。ESR1作為藥物調(diào)控靶點(diǎn)在惡性腫瘤領(lǐng)域中研究廣泛，有研究結(jié)果認(rèn)為其突變表達(dá)了一種有利于腫瘤進(jìn)展的獨(dú)特轉(zhuǎn)錄譜[24]。值得注意的是，目前ESR1在神經(jīng)疾病領(lǐng)域中的研究仍未見報(bào)道。

本研究中，GO功能富集分析結(jié)果提示，共同靶點(diǎn)主要參與了凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、對(duì)氧化應(yīng)激的響應(yīng)、神經(jīng)元死亡的調(diào)控和活性氧代謝過程的調(diào)控等BP，與上文所述核心靶點(diǎn)的生物學(xué)功能一致。KEGG通路富集分析中，PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路被顯著富集，結(jié)合核心靶點(diǎn)及GO功能富集分析結(jié)果，上述3條通路極有可能為黃芪-川芎治療SCI所調(diào)控的關(guān)鍵通路。有研究結(jié)果顯示，黃芪糖蛋白對(duì)急性脊髓損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)功能，可降低脊髓組織氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，可能與抑制NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)[25]。槲皮素通過抑制MAPK信號(hào)通路的激活，從而調(diào)節(jié)繼發(fā)性氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)SCI具有保護(hù)作用[26]。川芎嗪可通過抑制MAPK通路的激活，抑制活性氧的過量產(chǎn)生，防止線粒體功能障礙[27]。此外，川芎嗪還在脊髓損傷后具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制損傷后Akt磷酸化的降低有關(guān)[28]。

本研究中，成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)主要分析了活性成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性?；钚猿煞址矫妫茰y(cè)槲皮素、山柰酚、7-O-甲基異木糖醇、異鼠李堿和刺芒柄花素為治療SCI的重要活性成分。研究結(jié)果表明，槲皮素可顯著減少脊髓損傷后的髓鞘丟失和軸突丟失，還可促進(jìn)電生理恢復(fù)，減少空洞形成，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和軸突再生[29-30]。Liu等[31]認(rèn)為，山柰酚可以降低SCI后的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，該機(jī)制與下調(diào)MAPKs-NF-κB和信號(hào)通路相關(guān)。Chen等[32]研究結(jié)果表明，異鼠李堿可通過減輕氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞極化來促進(jìn)SCI大鼠的功能恢復(fù)。7-O-甲基異木糖醇、芒柄花素對(duì)SCI治療作用的研究甚少，這可能是未來研究的方向。成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)方面，PTGS1關(guān)聯(lián)數(shù)量最多，且可同時(shí)連接黃芪活性成分和川芎有效成分。PTGS1編碼的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成，且可能在腫瘤進(jìn)展過程中促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究結(jié)果表明，PTGS1與出血、血小板功能障礙以及調(diào)控脂肪干細(xì)胞在損傷部位的定向分化有關(guān)[33-34]。分子對(duì)接技術(shù)可以通過計(jì)算結(jié)合能量值評(píng)估小分子與靶蛋白的結(jié)合親和力，負(fù)值時(shí)提示兩者可有效結(jié)合[35]。本研究的分子對(duì)接結(jié)果顯示，PTGS1與活性成分槲皮素、山柰酚、7-O-甲基異木糖醇、亞油酸乙酯和楊梅酮均具有良好的親和力。上述結(jié)果提示PTGS1可能是一個(gè)潛在的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究對(duì)黃芪-川芎治療SCI的作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測(cè)，其可能與抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗神經(jīng)元凋亡及調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路等多途徑多通路相關(guān)。未來，課題組將通過實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性，并且深入揭示其作用機(jī)制。