基于調控FGF23/Klotho信號通路分析益腎寧改善慢性腎臟病鈣磷代謝紊亂的作用機制※

李 慧,李 紅

(1.山西中醫藥大學,山西 太原 030024；2.山西中醫藥大學附屬中西醫結合醫院,山西 太原 030024)

鈣磷代謝紊亂是慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)重要的臨床特征之一,會引起礦物質及骨代謝異常,導致腎性骨病、多系統損害、心血管事件高發等。目前CKD鈣磷代謝紊亂的主要治療措施為降低血磷、調整血鈣和處理繼發性甲狀旁腺功能亢進癥[1],但尚缺乏有力的證據證明降磷治療和限制飲食中磷的攝入可改善臨床預后,以及磷結合劑在CKD 3～4期患者中使用的安全性和有效性、含磷結合劑的安全劑量范圍、骨化三醇或擬鈣劑的應用能使患者臨床獲益。本課題組前期研究和臨床實踐表明,益腎寧治療CKD早期臨床療效較好,可明顯改善腎間質纖維化,調節鈣磷代謝紊亂[2]。近年來,成纖維細胞生長因子23(FGF23)/Klotho信號通路已成為CKD早期評估與治療的靶標[3],但其對CKD鈣磷代謝紊亂影響的研究較少。故本研究以FGF23/Klotho信號通路為切入點,探討益腎寧通過調控FGF23/Klotho信號通路改善CKD鈣磷代謝紊亂的作用機制,現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年1月就診于山西中醫藥大學附屬中西醫結合醫院腎病科的72例CKD 3期鈣磷代謝紊亂患者,采用隨機數字表法分為對照組和治療組,每組36例。對照組男19例,女17例；平均年齡(43.94±7.68)歲；平均病程(3.27±0.25)年；原發病:慢性腎小球腎炎13例,高血壓腎病10例,腎病綜合征13例。治療組男18例,女18例；平均年齡(44.53±5.59)歲；平均病程(3.43±0.12)年；原發病:慢性腎小球腎炎14例,高血壓腎病9例,腎病綜合征13例。兩組患者一般資料比較,差異均無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。本研究通過醫院醫學倫理委員會審查(倫理審批號:ZXY2022HY009)。

1.2 診斷標準 ①西醫診斷標準。參考文獻[4]診斷為鈣磷代謝紊亂:血清磷＞1.45 mmol/L,血清鈣≤2.10 mmol/L。參考文獻[4]診斷為CKD 3期:腎小球濾過率(GFR)為30～59 m L/(min·1.73 m2)。②中醫診斷標準。參考文獻[5]相關標準辨證為腎濁瘀阻證,主癥:倦怠乏力,腹脹納差,腰膝酸軟,夜尿清長；次癥:關節筋骨疼痛,肢體麻木、抽搐,皮膚瘙癢,肌膚甲錯,水腫,大便不成形或大便干結；舌苔脈象:舌質紫暗或淡紅,苔膩,脈沉細澀。具備以上癥狀中的2項主癥及1項次癥及以上者,即可診斷。

1.3 納入標準 年齡18～60歲；符合上述診斷標準；參與研究期間不接受其他方案治療；患者自愿參加本研究,并簽署知情同意書。

1.4 排除標準 無法遵守醫囑,依從性差者；合并肝、腦及造血系統等嚴重原發性疾病者；合并腫瘤、甲狀腺功能亢進癥、嚴重炎癥等消耗性疾病者；在本研究前3個月內參與其他臨床研究者。

2 治療方法

2.1 對照組 給予糾正水電解質紊亂,調節血壓,優質低蛋白、低磷飲食,口服碳酸鈣片(珠海同源藥業有限公司,國藥準字H44024255,0.75 g/片)等常規治療。碳酸鈣片每次0.75 g,每日3次。治療8周。

2.2 治療組 在對照組治療基礎上給予益腎寧顆粒劑(由天江藥業提供)口服。處方:黃芪、丹參、紅花、積雪草、車前子各30 g,當歸、川芎、何首烏各15 g,杜仲、豬苓、茯苓各12 g,桃仁、枳殼、清半夏、陳皮各10 g,制大黃9 g,甘草片、砂仁(后下)各6 g。每日1劑,早晚用開水沖服,治療8周。

3 療效觀察

3.1 觀察指標及療效評定標準 ①臨床療效。根據主癥的無、輕、中、重度分別計0、3、6、9分,根據次癥的無、輕、中、重度分別計0、2、4、6分,舌苔、脈象不計分。顯效:中醫證候積分降低＞60%,血肌酐(SCr)降低≥20%,血鈣(Ca)、血磷(P)、全段甲狀旁腺激素(iPTH)至少有2項在目標范圍之內；有效:中醫證候積分降低30%～60%,SCr降低≥10%且＜20%,血Ca、血P、iPTH僅有1項在目標范圍之內；無效:中醫證候積分降低＜30%,SCr升高,血Ca、血P、iPTH均不在目標范圍之內。總有效率＝(顯效例數＋有效例數)/總例數×100%。②FGF23、Klotho蛋白及血Ca、血P、iPTH、SCr水平。比較兩組治療前、治療4周和治療8周的血清FGF23、Klotho蛋白及血Ca、血P、iPTH、SCr水平。血清FGF23、Klotho蛋白運用酶聯免疫吸附試驗法測定,樣本及試劑于室溫(18～25℃)下解凍至少30 min,加入100μL標準品溶液,再加入50μL酶標記溶液,封板模密封后在37℃下孵育1 h,棄去液體,酶洗5次,吸水紙透徹拍干,加入顯色劑A 50μL和顯色劑B 50μL,在18～25℃下避光反應10 min,加入終止液50μL,終止反應,用酶標儀(波長450 nm)依次測量各孔的吸光度(OD值)。血Ca、血P、SCr水平采用BECKMAN-C800全自動生化分析儀測定,iPTH采用放射免疫法測定。

3.2 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,組內比較采用配對t檢驗,組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料用百分率(%)表示,采用χ2檢驗；相關分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

3.3 結果

(1)臨床療效比較 治療組總有效率為80.56%(29/36),對照組總有效率為63.89%(23/36),兩組比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組慢性腎臟病3期鈣磷代謝紊亂患者臨床療效比較(例)

(2)FGF23、Klotho蛋白比較 治療前,兩組患者FGF23、Klotho蛋白水平比較,差異均無統計學意義(P＞0.05)。治療4、8周,兩組患者FGF23水平均較治療前下降(P＜0.05),治療組FGF23水平低于同期對照組(P＜0.05)；兩組患者Klotho蛋白水平均較治療前升高(P＜0.05),治療組Klotho蛋白水平高于同期對照組(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組慢性腎臟病3期鈣磷代謝紊亂患者治療前后成纖維細胞生長因子23、Klotho蛋白水平比較(ng/mL,±s)

表2 兩組慢性腎臟病3期鈣磷代謝紊亂患者治療前后成纖維細胞生長因子23、Klotho蛋白水平比較(ng/mL,±s)

注:與本組治療前比較,△P＜0.05；與對照組治療后同期比較,▲P＜0.05。

組別 例數 時間 成纖維細胞生長因子23 Klotho蛋白治療組 36 治療前 549.28±162.73 456.94±124.16治療4周 502.84±92.47△▲ 530.84±98.47△▲治療8周 456.82±75.64△▲ 580.82±80.64△▲對照組 36 治療前 551.88±182.83 451.43±121.32治療4周 521.97±104.3△ 491.97±104.32△治療8周 503.54±84.72△ 520.54±84.72△

(3)血Ca、血P比較 治療前,兩組患者血Ca、血P水平比較,差異均無統計學意義(P＞0.05)。治療4、8周,兩組患者血Ca水平均較治療前升高(P＜0.05),治療組血Ca水平高于同期對照組(P＜0.05)；兩組患者血P水平均較治療前下降(P＜0.05),治療組血P水平低于同期對照組(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組慢性腎臟病3期鈣磷代謝紊亂患者治療前后血鈣、血磷水平比較(mmol/L,±s)

表3 兩組慢性腎臟病3期鈣磷代謝紊亂患者治療前后血鈣、血磷水平比較(mmol/L,±s)

注:與本組治療前比較,△P＜0.05；與對照組治療后同期比較,▲P＜0.05。

組別 例數 時間 血鈣 血磷治療組 36 治療前 1.80±0.19 1.81±0.33治療4周 2.13±0.13△▲ 1.42±0.35△▲治療8周 2.31±0.24△▲ 1.22±0.24△▲對照組 36 治療前 1.82±0.21 1.83±0.38治療4周 1.90±0.16△ 1.67±0.36△治療8周 2.17±0.29△ 1.46±0.39△

(4)iPTH、SCr比較 治療前,兩組患者iPTH、SCr水平比較,差異均無統計學意義(P＞0.05)。治療4、8周,兩組患者iPTH、SCr水平均較治療前下降(P＜0.05),治療組iPTH、SCr水平均低于同期對照組(P＜0.05)。見表4。

表4 兩組慢性腎臟病3期鈣磷代謝紊亂患者治療前后甲狀旁腺激素、血肌酐水平比較(±s,mmol/L)

表4 兩組慢性腎臟病3期鈣磷代謝紊亂患者治療前后甲狀旁腺激素、血肌酐水平比較(±s,mmol/L)

注:與本組治療前比較,△P＜0.05；與對照組治療后同期比較,▲P＜0.05。

組別 例數 時間 甲狀旁腺激素 血肌酐治療組 36 治療前 298.88±162.73 131.07±26.23治療4周 213.84±98.47△▲ 103.18±25.78△▲治療8周 176.82±75.64△▲ 90.15±24.93△▲對照組 36 治療前 309.45±153.69 130.19±28.17治療4周 253.97±104.32△ 112.23±26.03△治療8周 210.54±84.72△ 90.15±24.93△

(5)FGF23、Klotho蛋白與SCr、血Ca、血P、iPTH的相關性分析 FGF23與SCr、血P、iPTH呈正相關,與血Ca呈負相關；Klotho蛋白與SCr、血P、iPTH呈負相關,與血Ca呈正相關。見表5。

表5 成纖維細胞生長因子23、Klotho蛋白與血肌酐、血鈣、血磷、全段甲狀旁腺激素的相關性分析

4 討論

中醫認為,CKD鈣磷代謝紊亂屬于“虛勞”“骨痹”等范疇。本病發病之本在脾腎虧虛,腎為先天之本,藏先天之精氣,主骨生髓,亦主臟腑氣化,調控各臟腑形體官竅的功能；脾為后天之本,運化水谷精微而輸布四傍。先后天相互資生,腎中精氣不足,封藏失司,致骨不堅、髓不養和臟腑氣化失常。腎病及脾,脾虛則運化失司,水谷精微不能滋養腎精,骨髓得不到充養,五臟失養致氣血陰陽不足,周身乏力。發病之標為濕濁、瘀毒阻滯,脾制水,腎主水,脾腎衰憊,則水谷運化失司,輸布不及,聚而成濕,濕邪停聚,困阻三焦,氣機失常,日久化生濕濁、瘀毒等病理產物。濕濁、瘀毒阻滯氣血運行,致不通則痛,表現為骨關節刺痛、脹痛；形體官竅失于榮養,致不榮則痛,表現為骨關節酸痛、空痛；濁毒流于皮膚,血燥生風,致皮膚瘙癢,總的病機為腎濁瘀阻。

FGF23主要由骨細胞和成骨細胞合成和分泌。有實驗研究發現,FGF23基因缺陷小鼠表現為高鈣血癥、高磷血癥、異位鈣化、骨質疏松[6],FGF23基因過表達小鼠則表現為低磷血癥、佝僂病、骨軟化等[7]。FGF23主要通過其受體的介導及Klotho蛋白的協同作用以傳達生物學信號[8]。Klotho基因具有抗纖維化、抗氧化、抗細胞凋亡、抗炎等多種效應[9]。Klotho主要表達于腎小管上皮細胞中,有研究發現,CKD患者腎臟Klotho mRNA及Klotho蛋白表達水平均顯著下降,而Klotho蛋白缺乏可延緩腎臟修復,加重腎臟損傷[10]。Klotho基因編碼的膜型α-Klotho蛋白是作為FGF23發揮生物活性的輔助因子。膜型α-Klotho蛋白通過與成纖維生長因子受體(FGFR)結合成為FGF23的跨膜協同受體以實現FGF23/Klotho信號傳導[8],調節機體鈣磷代謝。FGF23/Klotho信號通路作用于腎近曲小管上皮細胞,抑制近端腎小管鈉-磷共向轉運體的表達,抑制對磷的重吸收；通過抑制維生素D合成并促進其分解,使活性維生素D水平下降[11],以降低腸道對鈣、磷的重吸收；也可直接抑制甲狀旁腺激素(PTH)的表達與分泌,然而CKD患者的低鈣高磷的內環境狀態持續刺激PTH的分泌,iPTH水平仍升高[12]。隨著CKD的進展,GFR持續下降,腎臟適應機制不足以維持磷攝取和排泄平衡,血P升高,FGF23持續上升,Klotho蛋白不能滿足逐步上升的FGF23所需要的結合位點,導致FGF23抵抗發生[13],使FGF23/Klotho信號通路失去對鈣磷代謝的有效調節。

益腎寧為山西中醫藥大學附屬中西醫結合醫院腎病科常用方劑。方中黃芪有補氣升陽、利尿消腫、生津養血之功。藥理研究顯示,黃芪能抑制CKD大鼠FGF23過高表達,上調Klotho蛋白表達,改善鈣磷代謝,延緩CKD大鼠腎功能損傷進展[14]。首烏、杜仲補益肝腎,益精填髓。陳皮、清半夏、茯苓、甘草有燥濕化痰、理氣和中之功,加砂仁、枳殼可增其行滯寬中之力。大黃通腑泄濁逐瘀,豬苓、車前子利水滲濕泄濁,使邪有出路。桃仁、紅花、川芎、當歸為桃紅四物湯加減,可滋補營血,補中寓行。丹參涼血活血,使瘀而不熱。積雪草清熱利濕,解毒消腫,研究證實其能抑制系膜細胞增殖及腎小球硬化,發揮抗炎、抗氧化、改善微循環、保護腎功能等多重作用[15]。諸藥合用,共奏補腎健脾、利濕排濁、解毒活血之功。

本研究結果顯示,益腎寧可提高臨床療效,升高Klotho蛋白、血Ca水平,降低FGF23、血P、iPTH、SCr水平,FGF23與血Ca呈負相關,與血P呈正相關,Klotho蛋白與血Ca呈正相關,與血P、PTH呈負相關,FGF23與Klotho呈負相關,表明益腎寧能改善CKD患者的臨床癥狀及腎功能,并通過調控FGF23/Klotho信號通路以改善鈣磷代謝紊亂,為臨床治療本病提供了新的思路與方法。