當歸多糖減輕大鼠肢體缺血再灌注后肝損傷及其機制

李巖 劉婭楠 李文娟 呂理澆 劉志漢 趙曉紅 張凌云 薛建軍

(1甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州 730050；2甘肅省中醫院麻醉科；3甘肅中醫藥大學)

急性肢體缺血是指各種原因導致的肢體灌注減少，并可能危害肢體活力，其中主要的發病原因是缺氧〔1〕，常見于止血帶使用時間過長、血栓、肢體急性創傷的等。急性肢體缺血除了可引起遠端肢體的缺血損傷外，還可通過內分泌-免疫機制引起全身臟器的損傷〔2〕。在缺血后的再灌注階段液體轉移進入周圍組織間隙，血管松弛因子如一氧化氮生成減少導致血管阻力增加，同時血管本身也通過抑制血管擴張和促進血管收縮的自我調節來應對全身炎癥反應，其結果周圍動脈血管強烈收縮，導致外周器官缺血缺氧并形成惡性循環〔3〕。缺血再灌注損傷時通常伴有全身炎癥反應，中性粒細胞募集激活補體級聯系統，炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞黏附分子和選擇素進入血循環并引發全身性補體級聯反應的激活〔4〕，因此缺血再灌注損傷的主要機制是大量的氧自由基釋放及復雜的細胞因子級聯風暴，使遠端器官的炎癥反應及氧化應激持續產生，臨床上可表現為多器官功能障礙，如急性腎衰竭和急性肺損傷，除此以外，肝臟也被認為是潛在的受累器官，其中炎癥和氧化應激是主要的損傷機制〔5〕，因此，抗炎和抑制氧化被認為是減輕急性肢體缺血再灌注導致的肝損傷的重要途徑。

當歸是一種多年生草本植物，由于其具有營養、補血和抗炎等作用，已廣泛應用于心血管疾病、肝纖維化和風濕性疾病的治療中。當歸多糖(AP)是當歸中最重要的生物活性成分，具有促進造血功能、免疫調節、抗腫瘤等生物學功能〔6,7〕。有研究發現AP可以抑制脂多糖(LPS)誘導的脊髓細胞凋亡和炎癥，保護細胞活性〔8〕。此外有研究顯示AP通過抑制核因子(NF)-κB及雙面激酶/信號傳導及轉錄激活因子(AK2/STAT3)通路調節HT22細胞中miR-10a水平，減輕LPS誘導的炎性損傷〔9〕。然而對于AP對肢體缺血再灌注后肝損傷的保護效應，目前尚無相關研究。為了進一步對AP的生物學效應進行研究，本文通過構建大鼠肢體缺血再灌注后肝損傷模型，探究AP減輕大鼠肢體缺血再灌注后肝損傷及潛在機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 健康SPF級雄性SD大鼠60只，2月齡，購于甘肅中醫藥大學實驗動物中心，倫理編號為：2018-102。大鼠雄性體重150～200 g，生產許可證號SCXK(甘)：2019002，大鼠在SPF環境下適應性飼養3 d，常規飲食，自由飲水。

1.1.2試劑 戊巴比妥鈉(用生理鹽水配制為1%溶液)，Tris·HCl緩沖液，4%多聚甲醛溶液，1%四氧化鋨等均購自蘭州科寶實驗器材有限公司；甲基丙二醇(MPO)試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β試劑盒購自美國R&D公司；TUNEL試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；NF-κB抗體和Nrf2抗體均購買自美國CST公司。

1.1.3儀器 電子天平，恒溫水浴鍋，低溫離心機，全自動酶標儀均購自美國Thermo公司，722紫外可見分光光度計和DH164電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海君恒醫療。

1.1.4受試藥物 AP購自MCE公司(中國)，為果膠酶法提取，利用苯酚-硫酸法測定得率約25%，經蘭州大學藥理學教研室鑒定符合藥典規定，質量合格，藥物純度99%，批號N-30SIK2。

1.2實驗動物及分組

1.2.1實驗分組 將60只大鼠按隨機數字表法隨機分為6 組：正常對照組(不做任何缺血處理，只灌胃給予生理鹽水)、模型組、陽性對照組(依達拉奉)，AP低劑量組，AP中劑量組、AP高劑量組，每組10只。

1.2.2AP給藥處理 AP的臨床給藥劑量為20 mg/kg，參照《藥理實驗方法學》〔10〕附錄里有關于各種動物之間給藥劑量換算系數的表，根據相應的系數計算，大鼠AP各劑量組灌胃劑量分別以50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg，用生理鹽水配制，每天1次(早晨9∶00)。陽性對照組依達拉奉以3 mg/kg灌胃，正常對照組、模型組用等量無菌生理鹽水灌胃處理。各組均連續灌胃7 d。灌胃期間每日嚴格觀察并記錄大鼠的生理狀況、活動狀況。

1.2.3肢體缺血再灌注損傷造模 用藥7 d后開始缺血再灌注損傷造模，造模前所有大鼠禁水2 h，1% 戊巴比妥鈉(25 mg/kg)腹腔注射麻醉，將麻醉完畢的大鼠四肢和頭部束縛于自制鼠板上，左后肢脫毛后，根部環扎橡皮筋夾閉左后肢股動脈，造成左后肢缺血，缺血2 h后，立即松開橡皮筋持續灌注6 h后再標本取樣。大鼠均采用相同彈性強度的橡皮筋，缺血時間和再灌注時間均嚴格控制，保證實驗對象間的均一性。

1.2.4標本采集和處理 各組大鼠，心臟采血4 ml；全血離心(4℃，1 000 r/min，離心20 min)后分裝血清，-20℃冰箱凍存，用于生化分析。收集血液后，解剖大鼠，迅速取肝臟，置于冰凍生理鹽水中反復漂洗，濾紙吸干，精密稱量臟器的重量，計算肝臟指數，肝臟指數=肝臟重量/大鼠體重×100%。取小塊肝臟組織保存于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常規石蠟包埋切片，其余凍存于-80℃冰箱。

1.2.5MPO檢測 肝臟勻漿的制備方法：采用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris·HCl)50 mmol/L，pH7.4制備肝勻漿。MPO檢測時，在96孔細胞板中加入待測血清20 μl或者肝臟組織勻漿液20 μl，加入200 μl過氧化氫反應液，然后加入200 μl顯色液(茴香胺反應液)65℃ 反應30 min，在酶標儀中波長 420 nm下測定各孔的OD值，并根據標準品曲線計算各孔MPO水平。

1.2.6檢測血清TNF-α、IL-1β水平 TNF-α,IL-1β水平主要運用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測，ELISA 操作主要步驟：用已經將TNF-α或IL-1β抗體吸附在固相載體的表面的試劑盒，加入相應血清反應30 min后，TBST洗板，加入TNF-α或IL-1β抗體反應2 h后，TBST洗板，加入酶的耦聯物反應30 min后洗板，最后加入酶相應的底物，反應顯色。顏色的深淺與固相載體上的抗原/抗體呈正比，用酶標儀讀取吸光度，帶入標準曲線中計算，即得所檢測因子的濃度。

1.2.7肝臟形態學檢測 4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常規石蠟包埋切片，石蠟切片脫蠟。切片充分脫蠟和水化后，將切片入蘇木素染3～8 min，蒸餾水洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，蒸餾水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。切片入伊紅染液中染色1～3 min染細胞質將切片依次放入95%酒精Ⅰ 5 min-95%酒精Ⅱ 5 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.8TUNEL染色 4%的多聚甲醛溶液中固定24 h，常規石蠟切片，切片充分脫蠟和水化，依次將切片放入二甲苯Ⅰ10 min-二甲苯Ⅱ10 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min，然后切片水化：95%酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸餾水洗反應充分、均勻。蛋白酶k孵育20 min細胞通透，加入TUNEL 37℃ 反應30 min，加入二氨基聯苯胺(DAB)反應10 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)充分清洗，顯微鏡鏡檢并拍照，圖像采集分析。

1.2.9Western印跡檢測 肝臟組織利用液氮粉碎組織塊，加入RIPA緩沖液和蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)震蕩勻漿，冰上孵育30 min，4℃ 14 500 r/min離心15 min，上清液為組織裂解液，加等體積的2×電泳加樣緩沖液，沸水浴中6 min，電泳上樣，電轉膜儀轉膜，然后經過封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育2 h后，Western印跡試劑盒顯色，分析比較記錄。

1.3統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、獨立樣本t檢驗、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠身體情況和肝臟指數比較 實驗過程中各組大鼠無死亡情況和明顯的體重降低情況。造模后模型組大鼠夾閉左后肢股動脈后血管搏動消失，肢體蒼白伴有攣縮，2 h后松開橡皮筋后，血管搏動恢復。實驗中大鼠麻醉后均蘇醒，模型組及藥物治療的造模大鼠均出現不同程度的精神萎靡，弓背，毛發聳立，而正常對照組無上述癥狀。

模型組肝臟指數明顯高于正常對照組(P<0.01)，表明模型組大鼠肝臟充血明顯增多。陽性對照組、AP各劑量組肝臟指數較模型組顯著降低(P<0.05，P<0.001)，提示肝臟充血損傷減輕。AD高、中劑量組較AP低劑量組肝臟指數降低，差異有統計學意義(P<0.05)，而AP中劑量組和高劑量組肝臟指數無統計學差異，提示AP對肝臟充血損傷具有一定的改善作用，但并未呈現劑量依賴式增加，而是具有一定的濃度域。見表1。

2.2各組大鼠肝損傷病理比較 模型組肝臟充血明顯，局部肝臟細胞片狀壞死，伴有肝臟細胞脂肪變性、水泡樣變性及炎癥反應，肝細胞損傷明顯，表明模型組大鼠存在明顯的肝臟損傷。在陽性對照組肝臟充血壞死明顯改善，僅可見少許肝臟脂肪樣變及炎細胞浸潤。AP各劑量組肝臟中細胞壞死同樣較模型組改善，炎癥細胞浸潤減少，僅表現為部分肝臟細胞水泡樣變。見圖1。

表1 AP對大鼠肝臟指數及TUNEL陽性細胞相對數量的影響

圖1 各組大鼠肝臟HE染色結果(×200)

2.3各組大鼠肝細胞凋亡水平比較 模型組大鼠肝臟組織中TUNEL染色陽性細胞較對照組顯著增多(P<0.01)，表明模型組肝臟細胞凋亡明顯。陽性對照組肝臟細胞TUNEL染色陽性細胞數量較模型組明顯較少(P<0.01)，表明依達拉奉對肝細胞具有一定的保護作用，可明顯降低肝細胞凋亡水平。AP各劑量組肝臟細胞TUNEL陽性細胞較模型組明顯減少(P<0.05，P<0.01)，表明AP處理后的大鼠肝細胞凋亡減少，提示依達拉奉及AP處理后，大鼠肢體缺血再灌注所致的肝細胞凋亡水平改善。見表1、圖2。

2.4各組大鼠血清MPO、TNF-α、IL-1β水平比較 模型組血清MPO水平明顯高于對照組(P<0.01)。各給藥組血清中MPO水平較模型組明顯降低(P<0.05，P<0.01)。模型組TNF-α,IL-1β水平顯著高于對照組(P<0.01)，各給藥組TNF-α,IL-1β水平較模型組顯著降低(P<0.05，P<0.01)。AP中劑量組的MPO、TNF-α、IL-1β水平較AP低劑量組明顯降低，而AP劑量組和高劑量組MPO、TNF-α、IL-1β水平無統計學差異(P>0.05)。見表2。

2.5大鼠肝臟組織中HO-1/Nrf2及TLR4/NF-κB通路激活水平 與正常對照組比較，模型組NF-κB表達升高，Nrf2下調，差異有統計學意義(P<0.01)。各給藥組與模型組比較，NF-κB表達下調的同時Nrf2表達升高，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2、圖3。

圖2 各組大鼠肝細胞凋亡水平比較(TUNEL，×200)

表2 AP對大鼠血清MPO、TNF-α、IL-1β的影響及HO-1/Nrf2、TLR4/NF-κB通路的激活

1～6：正常對照組，模型組，陽性對照組，AP低劑量組，AP中劑量組，AP高劑量組圖3 AP對HO-1/Nrf2及TLR4/NF-κB通路的激活

3 討 論

急性肢體缺血再灌注損傷期間，缺血組織釋放大量的炎癥因子及代謝產物進入血液循環，如肌酸酐磷酸激酶、肌紅蛋白、乳酸脫氫酶及鉀離子會干擾整個機體并導致炎癥反應，從而使肝臟、肺等非缺血器官發生炎癥反應，甚至多器官衰竭〔4〕，對于腎臟，血漿肌紅蛋白過量會導致腎小球的小動脈閉塞，誘發急性腎衰竭〔11〕，對于肺臟，急性肢體缺血損傷導致的系統性炎癥反應使血管通透性的增加，從而導致肺水腫〔12〕，對于遠端肢體缺血再灌注后各器官的易損程度，研究發現各個器官均易導致再灌注損傷，且組織之間再灌注損傷的嚴重程度沒有差異〔13〕，因此這一研究提示在肢體缺血再灌注后，應仔細監測遠端各臟器的功能。本研究結果顯示，當大鼠遠端肢體缺血再灌注后，可引起肝臟明顯的充血，產生氧化應激，誘發機體炎癥反應，導致大鼠肝臟細胞凋亡增加，本研究的大鼠肝損傷表型也與相關研究結果一致〔14,15〕。

雖然改善血流(再灌注)是克服肢體缺血的重要方法，然而，不適當的再灌注可觸發促炎介質的激活和活性氧(ROS)的形成，誘發全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征〔16〕，因此抑制氧化應激和炎癥反應是改善肢體缺血再灌注損傷的重要途徑，有研究發現給予肢體缺血再灌注大鼠模型生物堿千金藤素(Cepharanthine)后，由于Cepharanthine可抑制腫瘤壞死因子TNF-α介導的NF-κB激活，實驗中缺血再灌注模型大鼠的氧化應激水平和炎癥反應明顯降低〔17〕。AP具有眾多的生物學效應，AP目前已被證實在調節炎癥中具有一定的作用，研究發現AP給藥后不僅增強了巨噬細胞對抗原的攝取，也顯著提高了特異性免疫球蛋白(IgG)免疫應答和細胞因子水平，誘導了輔助性T細胞(Th)1/Th2混合免疫應答〔18〕。AP可通過抑制氧化應激水平，提高軟骨細胞的活性，改善骨關節炎〔19〕，因此上述研究提示AP對炎癥反應及氧化應激具有一定的抑制作用。

本結果表明，在大鼠肢體缺血再灌注后，肝細胞凋亡水平增加，炎癥反應及氧化應激水平增加，表現為TUENL染色陽性細胞增多，MPO、TNF-α和IL-1β水平顯著升高。當給予AP后，大鼠肝細胞凋亡水平及炎癥反應和氧化應激水平均顯著降低，表明AP可通過抑制炎癥反應和氧化應激水平對肢體缺血再灌注后的大鼠肝損傷具有一定的保護效應。AP的肝臟保護作用目前已有研究證實，有研究發現AP可降低過量對乙酰氨基酚誘導的大鼠肝損傷，改善脂質過氧化和氧化應激，并抑制細胞凋亡〔20〕，因此結合本實驗結果，提示AP可能是一種有潛力的肝保護劑。

為了進一步研究AP的潛在的肝損傷保護機制，本實驗檢測了調節氧化應激損傷的關鍵信號通路HO-1/Nrf2通路及與炎癥免疫機制密切相關的TLR4/NF-κB通路的激活水平，發現AP激活Nrf2/HO-1通路，抑制TLR4/NF-κB通路，降低肢體缺血再灌注后的肝損傷。有研究顯示AP可顯著提高了間充質干細胞的細胞活力，上調細胞周期蛋白D1、堿性磷酸酶(ALP)和骨形態發生蛋白(BMP)-2蛋白水平，促進細胞增殖和成骨細胞分化〔21〕，此外研究發現AP通過環腺苷酸(cAMP)反應元件結合信號通路顯著調控凋亡相關因子的表達，調節細胞凋亡〔22〕，那么AP是否通過調控細胞增殖和凋亡減輕肢體缺血再灌注后的肝損傷，將是下一步的研究重點。

綜上，AP通過下調TLR4/NF-κB炎癥信號通路，促進HO-1/Nrf2通路抑制氧自由基釋放及復雜的細胞因子級聯風暴，降低炎癥反應和氧化應激水平，緩解肢體缺血再灌注后的肝損傷，本研究為臨床治療肢體缺血再灌注后肝損傷提供了一種可能的治療策略。