miR-322-5p通過調控PRMT5表達對缺氧復氧誘導大鼠心肌細胞損傷的影響

張琮 趙佩 楊盛 張占海 張清會

(南陽醫(yī)學高等專科學校第一附屬醫(yī)院 1特需病區(qū)，河南 南陽 473000；2心血管內科)

急性心肌梗死(AMI)的治療會引發(fā)心肌缺血再灌注損傷(MIRI)，如何減輕MIRI是AMI臨床研究的熱點〔1，2〕。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，其可作為AMI診斷的生物標志物及治療靶點〔3〕。miR-322-5p是miRNA家族成員，參與多種疾病發(fā)展進程。研究表明，miR-322-5p在肺動脈高壓模型大鼠的右心室中〔4〕及高糖誘導的血管平滑肌細胞〔5〕中的表達水平降低。miR-322在脂多糖(LPS)刺激的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7中表達下調，上調miR-322能促進細胞增殖，緩解炎性損傷〔6〕。本研究通過TargetScan預測發(fā)現，蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMT)5可能是miR-322-5p的靶點。PRMT5在缺氧誘導的肺上皮細胞損傷中上調表達，其過表達誘導細胞凋亡〔7〕。PRMT5在缺血再灌注腎損傷和缺氧/復氧(H/R)誘導的HK-2細胞損傷中表達增加，干擾其表達可減輕缺血再灌注和缺氧復氧誘導的氧化損傷〔8〕。但miR-322-5p和PRMT5在H/R誘導的大鼠心肌細胞損傷中的表達、影響及兩者的關系目前還尚未可知。本課題建立H/R誘導的大鼠心肌細胞H9c2損傷模型，旨在研究miR-322-5p和PRMT5對H/R誘導的H9c2細胞氧化應激和細胞凋亡的影響及miR-322-5p能否靶向PRMT5發(fā)揮作用，以期為MIRI的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1材料 H9c2細胞系購自美國ATCC；胎牛血清(FBS)購自浙江天杭；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成；高糖/低糖DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自北京索萊寶；野生型(WT)和突變型(MUT)PRMT5熒光素酶載體、PRMT5小干擾RNA(si-PRMT5)、miR-322-5p模擬物(mimics)、小干擾RNA 陰性序列(si-NC)、miR-322-5p抑制劑(anti-miR-322-5p)、PRMT5過表達載體(pcDNA-PRMT5)、模擬對照序列(miR-NC)、空載體(pcDNA)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)和引物序列購自上海吉瑪制藥技術有限公司；聚合酶鏈反應(PCR)實驗所需試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Western印跡所需抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將H9c2細胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基)中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2H/R模型構建和實驗分組〔9〕H/R模型建立：根據文獻〔9〕方法，將H9c2細胞用缺氧培養(yǎng)箱(95%N2、5%CO2)中飽和的低糖無血清DMEM培養(yǎng)基置于缺氧培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)3 h，然后換為完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中復氧培養(yǎng)4 h。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測miR-322-5p和PRMT5 mRNA的表達 接種H9c2細胞至6孔板，接種密度為2×105個/孔。培養(yǎng)4 h后，分為對照(Con)組和H/R組。Con組細胞用完全培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)7 h。H/R組：按1.2.2建立H/R模型。培養(yǎng)結束后，將各組細胞中總RNA用試劑盒進行提取，并反轉錄合成cDNA，然后行PCR反應。引物序列：miR-322-5p上游5′-CAGCAGCAATTCATGTTTTGAA-3′，下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；PRMT5 上 游 5′-GGACGGAGAAGGGCAGACTA-3′，下 游 5′-CCCGCATCCAGAACATGGAA-3′；U6上 游5′-GTCGAGAGCTGAGCTGCAC-3′，下 游 5′-AGCGTAGCTCGGCCACGTA-3′；GAPDH上 游5′-CGATGCGCGCTGATCGCCC-3′，下 游 5′-GCGATGCTTTACTCTCTAC-3′。用2-ΔΔCt法分析miR-322-5p相對U6、PRMT5mRNA相對甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達量。

1.2.4細胞轉染 接種H9c2細胞至6孔板，接種密度為2×105個/孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合為一層時，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別轉染miR-322-5pmimics、miR-NC、anti-miR-322-5p、anti-miR-NC、si-PRMT5、si-NC、共轉染miR-322-5p mimics和pcDNA-PRMT5、miR-322-5pmimics和pcDNA，轉染時間6 h。實時熒光定量PCR檢測細胞中miR-322-5p表達或Western印跡檢測PRMT5蛋白表達，驗證轉染效果后，將各組細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.5檢測MDA含量及SOD和GSH-Px活性 將轉染miR-322-5p mimics、miR-NC、si-PRMT5、si-NC、共轉染miR-322-5p mimics和pcDNA-PRMT5、miR-322-5p mimics和pcDNA細胞均接種至6孔板，接種密度為2×105個/孔。培養(yǎng)4 h后，均按1.2.2建立H/R模型，分別記為H/R+miR-322-5p組、H/R+miR-NC組、H/R+si-PRMT5組、H/R+si-NC組、H/R+miR-322-5p+pcDNA-PRMT5組、H/R+miR-322-5p+pcDNA組。同時接種未轉染的H9c2細胞，按1.2.3分為Con組和H/R組。各組細胞培養(yǎng)結束后，裂解細胞，將裂解液3 500 r/min離心10 min。取上清液，分別利用MDA、SOD和GSH-Px試劑盒檢測上清液MDA含量、SOD和GSH-Px活性。

1.2.6流式細胞術測定細胞凋亡率 細胞分組同1.2.5。各組細胞培養(yǎng)結束后，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，利用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測各組細胞凋亡。

1.2.7Western印跡檢測PRMT5和凋亡相關蛋白 細胞分組同1.2.5。各組細胞培養(yǎng)結束后，收集細胞，將細胞中總蛋白用放射免疫沉淀試驗(RIPA)試劑進行提取。經二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離。將分離蛋白進行轉膜和封閉處理，用4℃冰箱中分別用PRMT5(1∶1 000)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2(1∶2 000)、Bcl-2相關X蛋白(Bax,1∶2 000)和GAPDH(1∶1 000)孵育過夜。洗膜，室溫條件下用羊抗兔二抗孵育2 h。加顯影液顯影，曝光拍照，ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.8雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 接種H9c2細胞至6孔板，接種密度為2×105個/孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合為一層時，利用LipofectamineTM2000試劑盒分別共轉染WT-PRMT5與miR-NC或miR-322-5p mimics、MUT-PRMT5與miR-NC或miR-322-5pmimics，轉染時間6 h。收集細胞并裂解，離心(半徑10 cm、3 500 r/min、10 min)。取20 μl上清液，向其中加100 μl 1×螢火蟲或海腎熒光素酶反應工作液，混合均勻后，檢測螢火蟲和海腎的熒光強度。以螢火蟲與海腎熒光強度的比值表示細胞熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1miR-322-5p和PRMT5在H/R誘導的大鼠心肌細胞H9c2中的表達 miR-322-5p在H/R組H9c2細胞中的含量較Con組顯著降低(0.43±0.04 vs 1.00±0.05，t=26.706，P<0.05)。H/R組H9c2細胞中PRMT5 mRNA和蛋白含量較Con組均顯著升高(mRNA：3.41±0.32 vs 1.00±0.06，t=22.207，P<0.05；蛋白：0.84±0.07 vs 0.41±0.04，t=16.000，P<0.05；)，見圖1。

圖1 PRMT5蛋白在H/R誘導的H9c2細胞中的表達

2.2過表達miR-322-5p對H/R誘導的大鼠心肌細胞氧化應激的影響 miR-322-5p在轉染miR-322-5pmimics的H9c2細胞中的表達量為(2.58±0.16)，較轉染miR-NC的細胞中的表達量(1.00±0.03)顯著升高(t=29.118，P<0.05)，說明過表達miR-322-5p的H9c2細胞構建成功。與Con組相比，H/R組H9c2細胞中MDA含量顯著增多，SOD和GSH-Px活性較Con組均顯著降低(P<0.05)；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-322-5p組H9c2細胞中MDA含量顯著減少，SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，見表1。說明H9c2細胞經H/R處理后，細胞抗氧化能力減弱；過表達miR-322-5p減輕H/R誘導的心肌細胞H9c2氧化損傷。

表1 過表達miR-322-5p對H/R誘導的H9c2細胞氧化應激及凋亡的影響

2.3過表達miR-322-5p對H/R誘導的大鼠心肌細胞凋亡的影響 與Con組相比，H/R組H9c2細胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表達量顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量顯著降低(P<0.05)；與H/R+miR-NC組相比，H/R+miR-322-5p組H9c2細胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表達量顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量顯著升高(P<0.05)，見表1，圖2，圖3。說明經H/R處理后凋亡加劇，而過表達miR-322-5p減少H/R處理的H9c2細胞凋亡。

圖2 凋亡相關蛋白表達

2.4敲減PRMT5對H/R誘導的大鼠心肌細胞H9c2氧化應激的影響 PRMT5蛋白在si-PRMT5的H9c2細胞中的表達量為0.20±0.02，較轉染si-NC的細胞中的表達量(0.41±0.04)顯著降低(t=14.087，P<0.05)，說明敲減PRMT5的H9c2細胞構建成功，見圖4。H/R組H9c2細胞中MDA含量較Con組增多，SOD和GSH-Px活性較Con組均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；H/R+si-PRMT5組H9c2細胞中MDA含量較H/R+si-NC組降低，SOD和GSH-Px活性較H/R+si-NC組均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。說明心肌細胞H9c2經H/R處理后細胞抗氧化能力減弱，敲減PRMT5可減輕H/R誘導的H9c2細胞氧化損傷。

圖3 細胞凋亡流式圖

圖4 轉染si-PRMT5的H9c2細胞中PRMT5蛋白表達

表2 敲減PRMT5對H/R誘導的H9c2 細胞氧化應激及細胞凋亡的影響

2.5敲減PRMT5表達對H/R誘導的H9c2細胞凋亡的影響 與H/R+si-NC組相比，H/R+si-PRMT5組H9c2細胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表達量較H/R+si-NC組降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量較H/R+si-NC組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2、圖5，圖6。說明H9c2細胞經H/R處理后凋亡加劇，敲減PRMT5減少H/R誘導的H9c2細胞凋亡。

圖5 凋亡相關蛋白表達

圖6 細胞凋亡流式圖

2.6miR-322-5p靶向調控PRMT5的表達 PRMT5的3′UTR序列與miR-322-5p互補的位點見圖7。共轉染WT-PRMT5與miR-322-5pmimics的H9c2細胞熒光素酶活性為(0.41±0.04)，較共轉染WT-PRMT5與miR-NC的細胞熒光素酶活性(1.00±0.06)顯著下降(t=24.545，P<0.05)；共轉染MUT-PRMT5與miR-322-5p mimics的H9c2細胞熒光素酶活性為(0.99±0.05)，與共轉染MUT-PRMT5與anti-miR-NC的細胞熒光素酶活性(0.97±0.07)差異無統(tǒng)計學意義(t=0.697，P=0.496)。PRMT5蛋白在轉染miR-322-5p mimics的H9c2細胞中的表達量較轉染miR-NC的細胞顯著降低(0.21±0.02vs 0.43±0.04，t=14.758，P<0.05)，PRMT5蛋白在轉染anti-miR-322-5p mimics的H9c2細胞中的表達量較轉染anti-miR-NC的細胞顯著升高(0.84±0.08 vs 0.42±0.04，t=14.087，P<0.05)，見圖8。說明miR-322-5p靶向結合并負調控PRMT5的表達。

圖7 PRMT5的3′UTR中含有與miR-322-5p互補的核苷酸序列

圖8 miR-322-5p對H9c2細胞中PRMT5蛋白表達的影響

2.7上調PRMT5逆轉了過表達miR-322-5p對缺氧復氧誘導的H9c2細胞損傷的作用 H/R+miR-322-5p+pcDNA-PRMT5組細胞中PRMT5蛋白表達量、MDA含量、細胞凋亡率和Bax蛋白表達量較H/R+miR-322-5p+pcDNA組均升高，SOD和GSH-Px活性和Bcl-2蛋白表達量較H/R+miR-322-5p+pcDNA組均降低(P<0.05)。見圖9，表3，圖10。說明上調PRMT5可逆轉過表達miR-322-5p對H9c2細胞氧化應激和凋亡的作用。

圖9 各組細胞凋亡流式圖

表3 上調PRMT5逆轉了過表達miR-322-5p對H/R誘導的H9c2細胞損傷的作用

1，2：H/R+miR-322-5p+pcDNA組、H/R+miR-322-5p+pcDNA-PRMT5組圖10 各組凋亡相關蛋白表達

3 討 論

研究表明，miRNA在治療不可逆心血管疾病(如AMI)以及修復/再生細胞療法的研究方面取得了進展〔10〕。研究發(fā)現，miR-322-5p在肺動脈高壓模型大鼠的右心室表達減少〔4〕，并可緩解炎癥損傷〔6〕。miR-322/503的表達在MIRI過程中減少，miR-322/503的過表達通過上調p-Akt和p-GSK3β的表達，減少梗死面積，抑制細胞凋亡，促進細胞增殖〔11〕。還有研究發(fā)現，轉染心臟祖細胞(CPCs)產生的胞外體miR-322(CPCexo-322)可通過增強梗死心臟邊緣區(qū)的血管生成，保護心臟梗死〔12〕。本研究結果說明過表達miR-322-5p可減輕H/R誘導的H9c2細胞氧化應激，并減少細胞凋亡，miR-322-5p對H/R誘導的心肌發(fā)揮保護作用。

PRMT5是組蛋白和非組蛋白上精氨酸殘基對稱二甲基化的主要酶，調節(jié)哺乳動物細胞從基因表達調節(jié)到細胞增殖和分化的許多生物學過程，PRMT5被認為是多種疾病的治療靶點，包括傳染病、心臟病和癌癥〔13〕。研究發(fā)現，PRMT5在心臟中高度表達，是心肌肥厚信號的重要調節(jié)因子，PRMT5的過度表達顯著抑制苯腎上腺素刺激心肌細胞GATA4的乙酰化和心肌肥厚反應，而PRMT5的敲除則誘導GATA4的活化和心肌細胞肥大，激活心臟中PRMT5的表達可能是預防心肌肥厚和心力衰竭的潛在治療方法〔14〕。本研究驗證了PRMT5在心肌細胞H/R損傷中的作用。此外，本研究結果提示miR-322-5p通過靶向下調PRMT5的表達來阻礙H/R誘導的H9c2細胞氧化應激和凋亡。

綜上，miR-322-5p是H/R處理的大鼠心肌細胞H9c2中表達下調的miRNA，過表達miR-322-5p可通過靶向下調PRMT5抑制H/R誘導的心肌細胞H9c2氧化應激和細胞凋亡，這提示miR-322-5p有望成為心肌細胞MIRI損傷分子治療的靶點。