新化合物LFG-500 誘導(dǎo)人乳腺癌細胞凋亡

王 凡 蔣海靜 李成林 ＊

（1.徐州醫(yī)科大學江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221000）

0 引言

乳腺癌是中國女性中最常見的癌癥。 美國2020年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示， 在確診癌癥的女性患者中，排名前三位的癌癥是乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌，共占新確診病例的50%，其中乳腺癌就占了30%。現(xiàn)有的乳腺癌治療方法包括化學治療、放射治療、靶向治療、免疫治療以及術(shù)前術(shù)后的內(nèi)分泌治療。 然而，作為一種惡性腫瘤，乳腺癌具有較高的轉(zhuǎn)移性，手術(shù)切除后極易復(fù)發(fā)，此外，用于化療的臨床藥物毒副作用較大，且腫瘤細胞極易產(chǎn)生耐藥性。 再加上早期篩查診斷方法的缺乏和高昂的治療成本，都使乳腺癌的治療困難重重。 因此，尋找有效的治療乳腺癌的方法是人類需要不斷攻克的難題，而探索高效低毒性的抗癌新藥尤為重要。

目前大部分細胞毒性抗癌藥物都是通過誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮作用。 凋亡是一種程序性細胞死亡的過程，機體在正常發(fā)育過程中可借助凋亡有效的清除一些無用細胞，控制細胞數(shù)量。 因此誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是研究抗腫瘤藥物的一個重要部分。 現(xiàn)代藥理學研究表明，天然黃酮類化合物具有抗菌、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用。 然而，天然黃酮類化合物溶解度差、首過效應(yīng)明顯、生物利用度極低。 LFG-500（CHNO，見圖1）是利用哌嗪基和芐基取代易于發(fā)生代謝的羥基，對黃酮母環(huán)進行結(jié)構(gòu)修飾后合成的全新化合物。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)LFG-500 具有較好的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用， 可抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231 侵襲，具有較好的抗腫瘤活性。 但是LFG-500 能否誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細胞凋亡尚未見報道。 因此，本文主要研究黃酮類新化合物LFG-500對乳腺癌細胞生長的抑制作用，初步探討其誘導(dǎo)細胞凋亡作用及可能的機制。 相關(guān)工作可為乳腺癌的治療、LFG-500 及黃酮類化合物的抗腫瘤研究與應(yīng)用提供堅實的實驗基礎(chǔ)。

圖1 LFG-500（C30H32N2O5）分子結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

LFG-500 （中國藥科大學江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點實驗室）； 人乳腺癌MCF-7 細胞株 （上海細胞庫）；1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；活性氧檢測試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、SDSPAGE 凝膠配制試劑盒、Western 一抗稀釋液、Western二抗稀釋液 （碧云天生物技術(shù)研究所）； 胰蛋白酶、MTT、DAPI、Bovine serum albumin（美國Sigma 公司）；Annexin V/propidium iodide（PI）凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（凱基生物有限公司）; BCA蛋白濃度測定試劑盒 （美國Thermo Scientific 公司）；PARP、pro-caspase-3/cleaved-caspase-3、pro-caspase-9/cleaved-caspase-9、Bcl-2/Bax 抗體 （美國CST 公司）；酶標儀（美國BioTek 公司）；恒溫CO培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司）；超凈工作臺（蘇凈集團空氣技術(shù)公司）； 倒置熒光顯微鏡 （日本OLYMPUS 公司）；Tanon 垂直電泳系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；流式細胞儀（德國Miltenyi 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

MCF-7 細胞接種于含10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素溶液的1640 培養(yǎng)基中， 于37℃、5%CO恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 當細胞狀態(tài)良好，細胞密度達到90%時傳代。

1.3 MTT 法

將MCF-7 細胞消化重懸， 按10個/孔加入96 孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，給予不同濃度的LFG-500 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）培養(yǎng)4h，取出96 孔板，棄去上清并加入100 μL/孔的DMSO 以溶解沉淀物，最后使用酶標儀于490 nm 處檢測其吸光度。 細胞活力的抑制率計算公式：

抑制率（%）=（A-A）/A×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測實驗

取對數(shù)生長期的細胞，以0.25%胰酶-EDTA 消化，配制成10個/mL 的單細胞懸液，接種于24 孔板中，每孔接種4×10個細胞，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后，將培養(yǎng)基替換為LFG-500 濃度為10 μM、20 μM、30 μM的1640 培養(yǎng)基，作用24 h。 根據(jù)試劑盒說明書，懸浮細胞200 g 離心5 min，收集；貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集。 用PBS 洗滌細胞2 次，200 g 離心5 min，收集細胞。 加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細胞，混勻后加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后加入5 μl PI，混勻。室溫、避光、反應(yīng)15 min。1h 內(nèi)使用流式細胞儀進行檢測。

1.5 細胞線粒體膜電位檢測

取對數(shù)生長期的細胞， 以0.25%胰酶-EDTA 消化， 配制成105 個/ml 的單細胞懸液， 接種于6 孔板中，每孔加入2 ml，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細胞貼壁后，將培養(yǎng)基替換為LFG-500 濃度為10 μM、20 μM、30 μM的1640 培養(yǎng)基，作用24 h。收集懸浮細胞，貼壁細胞消化后收集，與收集的懸浮細胞合并，用PBS 洗滌細胞2 次，200 g 離心5 min。 取500 μL 用去離子水稀釋的預(yù)熱至37℃的1×Incubation Buffer，加入1 μL JC-1 染料，渦旋混勻配成JC-1 工作液。 取500 μL JC-1 工作液將細胞均勻懸浮，培養(yǎng)箱中孵育20 min。 室溫離心200 g，5 min， 收集細胞，1×Incubation Buffer 洗2 次。吸取500 μL 1×Incubation Buffer 重新懸浮細胞，使用流式細胞儀進行檢測。

1.6 細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平檢測

分組及給藥同1.5。 收集懸浮細胞，并消化收集貼壁細胞， 合并。 按照1∶1000 用無血清的培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA 染料，使終濃度為10 μM。 每組加入1 mL稀釋好的DCFH-DA 染料，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞的DCFH-DA。最后加入500 μL 的無血清培養(yǎng)基，吹打均勻后，使用流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot 法檢測蛋白相對表達水平

分組及給藥同1.5。 消化收集細胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液充分裂解后，按BCA 蛋白測定試劑盒說明書測定樣本中蛋白濃度。 同時測定樣品的光密度值，計算蛋白含量，用裂解液將各樣品調(diào)至相同濃度，加入5×上樣緩沖液混合均勻，沸水10 min，使蛋白變性。變性后的蛋白樣品于-20°C 儲存。樣本采用10%～15% SDS-PAGE 進行分離， 將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，恒壓20 V，轉(zhuǎn)膜30 min。將膜用洗膜液洗滌3 次后， 轉(zhuǎn)移至含有封閉液的表面皿中，在脫色搖床上搖動封閉1 h，加入對應(yīng)的一抗4℃孵育過夜。 次日用洗膜液清洗3 次后，加入對應(yīng)的二抗室溫避光孵育2 h，洗膜液清洗3 次。 隨后使用Odyssey 掃描儀掃描， 保存所得圖像用Image J 軟件進行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（Mean±SEM）表示，數(shù)據(jù)符合方差齊性的采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間比較LSD檢驗； 若數(shù)據(jù)不符合方差齊性， 則采用Dunnett’s T3檢驗。 假設(shè)檢驗水準按α=0.05 判定。 *P＜0.05、**P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LFG-500 抑制人乳腺癌MCF-7 細胞活力

采用MTT 實驗考察不同濃度的LFG-500 對MCF-7 細胞生長的抑制作用。 結(jié)果顯示， 給予不同濃度的LFG-500 處理MCF-7 細胞24 h 后，LFG-500 對細胞活力的抑制作用隨著濃度的升高而逐漸增強（見圖2），其IC50 值為34.07±5.81 μM。依據(jù)MTT 實驗結(jié)果，選取10 μM、20 μM 和30 μM 的劑量開展后續(xù)研究。

圖2 LFG-500 對MCF-7 細胞活力的影響

2.2 LFG-500 對MCF-7 細胞形態(tài)的影響

用不同濃度的LFG-500 處理MCF-7 細胞24 h后， 于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。 如圖3 所示，對照組細胞貼壁生長，細胞輪廓清楚，細胞間結(jié)構(gòu)緊密，細胞生長旺盛；而隨著LFG-500 劑量的增加，細胞生長受到抑制，細胞變得分散，部分細胞變圓、漂浮。

圖3 不同濃度LFG-500 處理MCF-7 細胞24h 的細胞形態(tài)（200×）

2.3 LFG-500 誘導(dǎo)MCF-7 細胞發(fā)生凋亡

采用Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒， 利用流式細胞儀分析LFG-500 對MCF-7 細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。結(jié)果如圖4 所示，LFG-500 處理MCF-7 細胞24 h后，高劑量組凋亡率達到40.27±3.57%，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異（**P＜0.01）。上述結(jié)果表明，LFG-500可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細胞凋亡，繼而抑制其生長。

圖4 不同濃度LFG-500 處理MCF-7 細胞24h 的細胞凋亡率

2.4 LFG-500 降低MCF-7 細胞線粒體膜電位水平

JC-1 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果如圖5 所示，與對照組相比，10 μM、20 μM 和30 μM LFG-500 組線粒體膜電位分別降 低了22.33±4.77%、28.85±6.40%、53.52±16.38%， 提示LFG-500 可能通過降低細胞線粒體膜電位，繼而激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細胞凋亡。

圖5 不同濃度LFG-500 對MCF-7 細胞線粒體膜電位的影響

2.5 LFG-500 誘導(dǎo)MCF-7 細胞內(nèi)ROS 水平升高

ROS 水平檢測結(jié)果如圖6 所示， 與對照組相比，LFG-500 處理MCF-7 細胞24 h， 中高劑量組細胞內(nèi)ROS 水平顯著增高，且該作用具有劑量依賴性。 上述結(jié)果提示，LFG-500 促進MCF-7 細胞內(nèi)ROS 蓄積。

圖6 不同濃度LFG-500 對MCF-7 細胞內(nèi)ROS水平的影響

2.6 LFG-500 對MCF-7 細胞中線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的影響

Western blot 實驗結(jié)果，由圖7 可以看出，與對照組相比，LFG-500 給藥組隨著劑量增大，Bcl-2 蛋白表達逐漸減少，Bax 蛋白表達逐漸增多。 同時，由圖8 可以看出， 細胞中pro-caspase-9 和pro-caspase-3 的蛋白水平顯著降低， 而cleaved caspase-9 和cleaved caspase-3 蛋白水平明顯升高， 說明pro-caspase-9 和pro-caspase-3 分別被LFG-500 活化。 且與對照組相比，LFG-500 可顯著降低PARP 的原型表達水平。

圖7 不同濃度LFG-500 對MCF-7 細胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表達水平的影響

3 討論

腫瘤細胞的無限增殖是惡性腫瘤的十大特征之一，而凋亡失調(diào)是導(dǎo)致腫瘤細胞無限增殖的重要因素。 細胞凋亡又稱程序性的細胞死亡，是指細胞受到某種刺激或接收到某種信號后為了維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的由基因調(diào)控的細胞自主有序的死亡過程。 細胞凋亡具有獨特的形態(tài)特征和生化特征， 包括細胞皺縮、細胞膜出芽、染色質(zhì)凝聚、核仁碎裂、DNA 片段化，接著形成凋亡小體被周圍的巨噬細胞吞噬，最后被溶酶體溶解。 腫瘤細胞凋亡在抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。 因此，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，并闡明其可能的機制對于尋找新的抗癌藥物具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類新化合物LFG-500 可顯著抑制人乳腺癌MCF-7 細胞生長，并呈劑量依賴性（見圖2）。光鏡觀察和Annexin V-FITC/PI 雙染結(jié)果都表明，LFG-500 能誘導(dǎo)人乳腺癌細胞MCF-7 發(fā)生凋亡 （見圖3、圖4），這提示LFG-500 對細胞生長的抑制作用可能與其誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

細胞凋亡包括外源性死亡受體通路和內(nèi)源性線粒體凋亡通路。 在線粒體凋亡通路中，當細胞受到內(nèi)部凋亡因子的刺激時，如癌基因激活的DNA 損傷、細胞缺氧以及細胞生長因子的缺失，會導(dǎo)致線粒體膜電位降低， 膜通透性增加， 從而使促凋亡因子Cyt C 和AIF 釋放到細胞質(zhì)中。Cyt C 在細胞內(nèi)會結(jié)合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1） 形成凋亡復(fù)合物，繼而激活pro-caspase-9 以及下游的pro-caspase-3，pro-caspase-3 被激活后會分解底物，如PARP，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。因此，本研究在明確LFG-500 誘導(dǎo)MCF-7 細胞凋亡的基礎(chǔ)上， 考察LFG-500 誘導(dǎo)細胞凋亡是否與調(diào)控線粒體凋亡通路相關(guān)。 結(jié)果顯示，LFG-500 可降低線粒體膜電位（見圖5），可抑制procaspase-9 和pro-caspase-3 的 表 達， 促 進cleaved caspase-9 和cleaved caspase-3 的蛋白表達，同時下調(diào)PARP 的蛋白表達 （見圖8）。 說明LFG-500 可刺激MCF-7 細胞，活化pro-caspase-9 和pro-caspase-3，繼而促進PARP 切割，激活線粒體凋亡通路。

圖8 不同濃度LFG-500 對MCF-7 細胞中PARP及caspase 相關(guān)蛋白表達水平的影響

ROS 參與多種生物學進程，在細胞信號、生物合成過程和宿主防御方面都發(fā)揮重要作用。 在腫瘤細胞內(nèi)，ROS 水平的升高和降低作為一種輕度氧化應(yīng)激反應(yīng)，參與多種致癌途徑的激活。 但是，持續(xù)的ROS 蓄積，特別是ROS 自由基的蓄積，會對DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成損傷，影響細胞正常生長。ROS 水平升高， 會刺激線粒體膜電位降低， 促使線粒體將ROS 釋放至細胞質(zhì)中，引起過度氧化應(yīng)激反應(yīng)，而這種過度氧化應(yīng)激反應(yīng)又會刺激周圍線粒體釋放更多的ROS，最終導(dǎo)致細胞死亡。 此外，Bcl-2 蛋白家族也參與到線粒體凋亡通路中，Bax/Bcl-2 的比例決定了細胞內(nèi)線粒體凋亡通路是否被激活。 通過實驗發(fā)現(xiàn)，MCF-7 細胞經(jīng)過LFG-500 處理后，細胞內(nèi)ROS 水平明顯升高（見圖6），同時，LFG-500 可上調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，即增加Bax/Bcl-2 的比值（見圖8）。 提示LFG-500 可能是通過促進細胞內(nèi)ROS 積聚、線粒體膜電位擴散，激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抑制MCF-7 細胞生長的作用。

4 結(jié)語

綜合以上研究結(jié)果可知， 當MCF-7 細胞受到LFG-500 干預(yù)后，引起細胞內(nèi)ROS 水平顯著升高，過量的ROS 誘導(dǎo)MCF-7 細胞線粒體膜電位降低， 激活了線粒體凋亡通路， 最終導(dǎo)致細胞凋亡。 本實驗為LFG-500 的抗癌作用研究提供了理論基礎(chǔ)，希望能為乳腺癌藥物治療提供新的思路。