基于生物信息學構建卵巢漿液性腺癌預后風險模型 及潛在中藥預測分析

盛超，金芳和

1 湖南中醫藥大學 湖南長沙 410208 2 湖南中醫藥大學附屬常德醫院 湖南常德 415000

根據卵巢惡性腫瘤診斷與治療指南（2021年版）指出[1]，卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，發病率在女性生殖系統惡性腫瘤中位居第3 位，病死率居婦科惡性腫瘤之首。卵巢癌以上皮性腫瘤最為常見，占90%以上。占5%~6%，生殖細胞腫瘤占2%~3%[2]。在上皮性卵巢癌中，高級別漿液性癌（high grade serous carcinoma，HGSC）占70%，子宮內膜樣癌占10%，透明細胞癌占10%，黏液性癌占3%，低級別漿液性癌（low grade serous carcinoma，LGSC）＜5%[3]。其中在卵巢漿液性腺癌（Ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）中，高級別漿液性癌與低級別漿液性癌均為惡性腫瘤[1]。而對于上皮性卵巢癌的化療，卡鉑-紫杉醇聯合化療仍然是一線化療的首選方 案[4]。然而，由于耐藥性強，大多數患者最終復發，特別是對于鉑類藥物[5]。因此，藥物的選擇對于OV 靶點的干預顯得尤為重要。

本研究采用生物信息學方法，以OV 核心差異預后基因為落腳點，構建OV 預后風險評分系統，開發有效的臨床預后預測模型，分析預后基因的免疫浸潤情況，望篩選出臨床有效治療OV 的潛在中藥，為中醫藥干預卵巢癌提供了新思路。

資料與方法

1 卵巢漿液性腺癌差異預后基因的獲取

通過癌癥基因組圖譜TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）數據庫，下載卵巢漿液性腺癌RNAseq 及其對應臨床信息數據。

采 用R 語 言DESeq2 包[6]，以 |log2（FC）|＞1.0、p.adj＜0.05 為篩選條件，對卵巢漿液性腺癌轉錄組數據進行差異分析，獲取卵巢漿液性腺癌差異基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）。

采用R 語言survminer、survival 包，以卵巢漿液性腺癌患者的總體生存期（Overall Survival，OS）及生存時間為結局變量，通過單因素Cox 回歸分析，以P＜0.05 為篩選條件，獲取卵巢漿液性腺癌預后分子[7]。

通 過Bioinformatics（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/beg）數據庫，取卵巢漿液性腺癌差異基因及預后分子的交集，繪制韋恩圖，獲取卵巢漿液性腺癌差異預后基因。

2 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因的獲取及表達相關性分析

采用R 語言survminer 包[7]構建卵巢漿液性腺癌差異預后基因的Kaplan-Meier（KM）生存曲線，以卵巢漿液性腺癌差異預后基因表達的中位值為臨界值，將卵巢漿液性腺癌患者分為高、低表達組，繪制生存曲線，評判高、低表達在卵巢漿液性腺癌中的生存預后價值，以P＜0.05 為篩選條件，聚焦卵巢漿液性腺癌差異預后基因。

通 過TCGA、GTEx（https：//commonfund.nih.gov/GTEx/）數據庫[8]，采用R 語言 pROC 包、ggplot2 包繪制受試者工作特征曲線（Receiver Operating Characteristic curve，ROC），以AUC＞0.7 為篩選條件，聚焦卵巢漿液性腺癌差異預后基因。同時滿足KM 生存曲線P＜0.05，且AUC＞0.7 的卵巢漿液性腺癌差異預后基因納入為核心差異預后基因。

為進一步研究核心差異預后基因在卵巢漿液性腺癌患者中的表達及其相關性，對TCGA 數據集中卵巢漿液性腺癌樣本數據進行非配對樣本t 檢驗及Spearman 相關性分析，并采用R 語言ggplot2 包繪制箱式圖、相關性熱圖及弦圖。

3 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因風險評分系統構建及臨床預測模型開發

采用R 語言survival 包，對卵巢漿液性腺癌樣本中7 個核心差異預后基因表達數據與臨床信息OS 及生存時間，進行單因素及多因素Cox 回歸分析，計算風險評分（Riskscore）。風險評分為各核心差異預后基因表達量與其對應多因素Cox 回歸系數的乘積之和。以風險評分的中位數為截斷值，將TCGA 數據集中379 例卵巢漿液性腺癌樣本分為高、低風險組。采用KM 生存曲線與時間依賴性ROC 曲線對風險評分系統進行生存預后分析，并評估其1年、3年、5年生存預后。

納入卵巢漿液性腺癌患者的臨床信息與風險評分，包括FIGO 分期、療效評價、年齡、Grade 分級、解剖腫瘤分部、靜脈入侵、淋巴入侵、腫瘤殘留、腫瘤狀態、腫瘤有無情況，進行單因素及多因素Cox 回歸分析，將單因素Cox 分析得到的P＜0.1 的自變量進一步納入多因素Cox 回歸模型，篩選卵巢漿液性腺癌的獨立預后因子。采用R 語言rms 包構建獨立預后因子的臨床預測模型諾莫圖，并分子總體評分的1年、3年、5年生存概率分析。最后采用Calibration 分析與決策曲線分析（Decision Curve Analysis，DCA）對卵巢漿液性腺癌臨床預測模諾莫圖進行評價。

4 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因的免疫浸潤相關性分析

通過TCGA 數據庫，以P＜0.05 為篩選條件，采用CIBERSORT 反卷積法篩選卵巢漿液性腺癌樣本數據，分析卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因與各免疫細胞間的 Spearman 相關系數[9-10]，采用R 語言ggplot2 包繪制卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因與免疫浸潤中免疫細胞的相關性熱圖。

5 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因的潛在中藥預測

通 過Coremine（https：//www.coremine.com/medical/）、TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）、TCMIP（http：//www.tcmip.cn/）數據庫，以P＜0.05 篩選條件，反向篩選卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因潛在中藥。

結果

1 卵巢漿液性腺癌差異預后基因的獲取

采用R 語言DESeq2 包，獲取卵巢漿液性腺癌346 個DEGs，其 中270 個 高 表 達，76 個 低 表 達（圖1A）；采用survminer、surcival 包單因素cox 回歸，獲取1645 個預后分子。取差異基因及預后分子的交集，獲得14 個卵巢漿液性腺癌差異預后基因（圖1B、表1）

表1 卵巢漿液性腺癌差異預后基因描述及主要功能

圖1 卵巢漿液性腺癌差異預后基因火山圖及韋恩圖

2 卵巢漿液性腺癌差異核心預后基因及其表達相關性分析

以P＜0.05 且AUC＞0.7 為篩選條件，采用KM 生存曲線與ROC 曲線，分析卵巢漿液性腺癌差異預后基因的生存預后，發現C20orf204 與卵巢漿液性腺癌患者生存預后不顯著（P＞0.05），MCCD1、KRT4、TEX37、FO681492.1、ERVMER34-1、BLK 的ROC 診斷效價較低（AUC＜0.7），AUG 值依次為：0.699、0.619、0.618、0.553、0.497、0.479。最終納入SAA2-SAA4、FGF20、ADGRG5、EPB41L1、TRPM3、DAP1、KLK3 共7 個卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因，其中SAA2-SAA4、ADGRG5、EPB41L1、DAP1 在卵巢漿液性腺癌中顯著高表達（P＜0.001），FGF20、TRPM3、KLK3 在卵巢漿液性腺癌中顯著低表達（P＜0.001）（圖2A）。

進一步表達相關性研究發現（圖2B、圖2C），SAA2-SAA4 與DAPL1 正 相 關 性 最 強（cor=0.18），與KLK3 負 相 關 性 最 強（cor=-0.06）。FGF20 與TRPM3 正相關最強（cor=0.24），與DAPL1 負相關性最 強（cor=-0.05）。ADGRG5 與EPB41L1 正 相 關 最強（cor=0.14），與KLK3 負相關性最強（cor=-0.09）。EPB41L1 與KLK3 正相關最強（cor=0.16），與TRPM3負相關性最強（cor=-0.01）。TRPM3 與FGF20 正相關最強（cor=0.24），與SAA2-SAA4 負相關性最強（cor=-0.08）。DAPL1 與SAA2-SAA4 正相關最強（cor=0.18），與KLK3 負相關性最強（cor=-0.12）。KLK3 與EPB41L1 正相關最強（cor=0.16），與DAPL1 負相關性最強（cor=-0.12）。

圖2 卵巢漿液性腺癌差異核心預后基因表達差異及分子間相關性

3 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因風險評分系統構建及臨床預測模型開發

對卵巢漿液性腺癌樣本中7 個核心差異預后基因多因素Cox 回歸分析發現（圖3A），SAA2-SAA4、ADGRG5、TRPM3、DAPL1（P＜0.05）均可作為卵巢漿液性腺癌的獨立預后基因。KM 生存曲線（圖3B）與時間依賴性ROC 曲線（圖3C）發現，7 個核心差異預后基因構建的風險評分系統能顯著區分生存，低風險評分具有的生存預后（P＜0.001），風險評分的HR=2.03＞1（95%CI，1.55-2.64），是卵巢漿液性腺癌的 危 險 因 素；time-ROC 的1年、3年、5年AUC 面 積分別為0.629、0.622、0.684，提示風險評分能較好的評估生存預后，且5年的預測能力最佳。

對納入卵巢漿液性腺癌患者的臨床信息與風險評分進行單因素、多因素Cox 回歸分析（圖3D、E），發現FIGO 分期、年齡、腫瘤狀態、腫瘤有無、風險評分是卵巢漿液性腺癌患者的預后因素，進一步多因素Cox回歸分析發現腫瘤有無與風險評分是卵巢漿液性腺癌患者的獨立預后因子。納入腫瘤有無與風險因子，構建臨床預測模型諾莫圖，以預測1年、3年、5年的生存概率（圖3F）。Calibration 預后（圖3G）與DCA（圖3H）分析發現，卵巢漿液性腺癌臨床預測模型諾莫圖具有較好的預測效能，DCA 亞型分析發現腫瘤有無與風險評分聯合評價生存預后具有更好的效能。

圖3 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因風險評分系統構建及臨床預測模型開發

4 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因的免疫浸潤結果

卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因與免疫浸潤細胞的相關性熱圖表明（圖4），SAA2-SAA4 分子與Neutrophils 細胞呈現出最強的正相關性（cor=0.367）、與NK cells 細胞呈現出最強的負相關性（cor=-0.098）；FGF20 與Tcm 細胞呈現出較強的最相關性（cor=0.118）、與Treg 細胞呈現出最強的負相關性（cor=-0.100）；ADFRG5 與B 細胞呈現出最強的正相關性（cor=0.494）；EPB4L1 與Th17 細胞呈現出最強的正相關性（cor=0.205）、與Th2 cells 呈現出最強的負相關性（cor=-0.285）。TRPM3 與NK 細胞呈現出最強的正相關性（cor=0.220）、與Th17 cells 呈現出最強的負相關性（cor=-0.094）；DAPL1 與Th17 cells 細胞呈現出最強的正相關性（cor= 0.119）、與NK 細胞呈現出最強的負相關性（cor=-0.263）；KLK3 與NK 細胞呈現出最強的正相關性（cor=0.218）、與 Cytotoxic cells 細胞呈現出最強的負相關性（cor=-0.216）。

圖4 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因與免疫浸潤細胞相關性熱圖

5 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因的潛在中藥預測結果

Coremine 數據庫預測出FGF20 等4 個卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因的卵巢漿液性腺癌潛在中藥共18 個，其中，FGF20、EPB41L1 均與一味中藥相關（地榆、水蛭），DAPL1 與7 味中藥相關（三七葉等），KLK3 與9 味中藥相關（蟛蜞菊等），且地榆、三七葉、三七花度值較高，提示其與卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因的關系更為密切（圖5A）。

卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因歸經數量從大到小依次為：KLK3＞DAPL1＞FGF20＞EPB41L1，藥物多歸于肝經（圖5B），功效多與補虛止血相關（圖5C）。其中，整合Coremine 數據庫、TCMSP 數據庫、TCMIP數據庫發現，尚未有報道顯示能結合SAA2-SAA4、ADGRG5 TRPM3 此3 個卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因的有效組分/中藥。

圖5 卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因潛在中藥網絡圖

討論

腫瘤的發生發展、損傷修復、死亡與增殖是一個連續的過程，是基因、炎癥及miRNA 改變等綜合因素作用的結果[11-12]。而卵巢漿液性腺癌作為最常見的卵巢癌，發展迅速，極易出現盆腹腔播散和腹膜后淋巴結轉移[13]。卵巢漿液性腺癌的發生、發展是一個是多因素、多步驟、多階段和多基因改變的結果，其中包括抑癌基因的失活與激活，這兩種改變可使細胞生長和分化的調節失控，進一步導致基因突變和細胞異常增殖[14]。因為缺乏特異性癥狀和缺乏有效的早期診斷方法，大多數卵巢漿液性腺癌患者在晚期才被診斷出來，這導致了此類患者預后不良[15]。卵巢漿液性腺癌的發病率呈上升趨勢，化療作為治療卵巢漿液性腺癌的主要手段，而長期化療常常使卵巢漿液性腺癌患者的精神處于焦慮的狀態，因此，有效的治療方法成為高發病率、高轉移率的卵巢漿液性腺癌患者的迫切需要[16]。

本研究以TCGA 數據庫臨床信息為源，對OV 進行差異分析與預后分子的篩選，發現OV 有342 個DEGs，其中270 個DEGs 高表達，72 個DEGs 低表達，OV 存在1645 個預后分子。通過將得出的14 個OV差異預后基因構建 KM 生存曲線與ROC 曲線，最終得到SAA2-SAA4、FGF20、ADGRG5 等7 個OV 核心差異預后基因，提示其可作為干預OV 的分子。KM 生存曲線、時間ROC 曲線揭示了OV 低風險組患者預后較好，且對5年OV 患者的預測最為準確。通過多因素Cox 回歸分析，構建了卵巢漿液性腺癌的風險評分系統，明確風險評分可以作為獨立預后危險因子，低風險評分具有良好的生存預后。同時以風險評分為基礎，開發了卵巢漿液性腺癌的臨床預測模型諾莫圖，并對其進行評價，對1年、3年、5年的生存預后具有較好的預測效能，可進行臨床推廣。免疫浸潤結果構建了7 個卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因與24種免疫細胞的相關性，并計算了靶基因與免疫細胞的相關性系數。Coremine 數據庫預測出18 個OV 潛在中藥，藥物多歸于肝經，功效多與補虛止血相關，為中醫藥干預OV 提供了理論依據。

已有研究指出，SAA2-SAA4 與透明細胞腎癌（ccRC）的發生有關[17]。FGF20 可抑制腫瘤血管的生成和生長[18]。Abanoub A.Gad 指出，ADGRG5 的表達下調可延緩乳腺癌細胞粘附。研究表明，EPB41L5與多形性膠質母細胞瘤、結直腸癌、腎透明細胞癌等腫瘤疾病的發生發展及轉移有關[19-21]。陳利俠指出，TRPM3 可通過Wnt/β-catenin 信號通路誘導上皮性卵巢癌細胞上皮間質轉化[22]。 DAPL1 通過細胞生長、衰老和細胞凋亡等過程影響卵巢顆粒細胞的壽命，與卵巢顆粒細胞的發生、生長、分化有關[19，23]。 DAPL1也可通過低甲基化影響肺癌患者的預后[24]。 KLK3可通過抑制血管生成起到促進腫瘤生長與轉移擴散的 作 用[25]。因 此，SAA2-SAA4、FGF20、ADGRG5、EPB41L5、TRPM3、DAPL1、KLK3 均可作為與腫瘤發生發展相關的靶點。

中醫認為，卵巢漿液性腺癌可歸于“石瘕”“癥瘕”等范疇。《金匱要略》揭示了瘀血、水濕留滯，積久成癥是形成卵巢癌的主要原因[26]。卵巢癌的總體病機為本虛標實，正虛為本，邪實為標，正氣虧虛，六淫邪氣乘虛入侵，與氣血相搏，導致氣血失調，瘀血內停，集于胞絡之中，日久痰、瘀、毒邪滯留成癌[27]。瘀血既是致病因素，又是病理產物[26]。活血化瘀是臨床治療腫瘤的常用方法，該方法對惡性腫瘤有抑制轉移作用，且不良反應較少，還可增強化療藥物的療效[28]。因此，活血化瘀療法可作為治療卵巢癌的基本治法。三七葉作為化瘀止血藥，其中的有效成分三七素具有止血之功、人參皂苷Rg1 兼活血之效，在止血的同時又可活血而不留瘀[29]。三七葉可通過抑制腫瘤細胞誘導的血小板聚集從而起到抑制腫瘤生長、轉移的作用[30]。三七花清熱解毒以抑菌抗癌。地榆中的地榆皂苷具有低毒性、高脂溶性以及抗腫瘤活性強等優點，可通過增強細胞凋亡蛋白caspase-3 和caspase-9的活性、抑制VEGF 的表達等，也可通過直接殺死腫瘤細胞、誘導細胞凋亡、調節細胞周期和抑制腫瘤轉移，最終導致腫瘤細胞凋亡或壞死[31]。吳曉晴[32]通過對益氣活血解毒方（生黃芪30g、枸杞子15g、炒白術15g、山藥15g、三棱6g、莪術9g、女貞子15g、海藻15g、青皮9g、烏藥9g、肉桂6g、青蒿12g、白花蛇舌草15g）治療鉑耐藥卵巢癌療效，和對巨噬細胞表型的影響研究，顯示其可延長晚期鉑耐藥卵巢癌患者的PFS，能降低外周血中IL-6 水平，緩解免疫抑制。李航等[33]發現對復方丹參滴丸（丹參、三七為主要提取物）能夠有效的抑制住腫瘤組織內的VEGF 水平，誘導腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤的細胞的增長和遷徙。因此，三七葉、三七花、地榆可作為臨床干預卵巢漿液性腺癌的中藥。

本研究基于生物信息學多種數據庫，構建卵巢漿液性腺癌風險評分系統及臨床預測模型，通過篩選卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因，并對卵巢漿液性腺癌核心差異預后基因進行免疫浸潤的分析、潛在中藥的預測，為中醫藥干預婦科腫瘤提供了可行性思路。