錯配修復蛋白及程序性死亡蛋白配體1在子宮內膜癌中的表達及意義

任單陽，徐 萌

（1.單縣中心醫院病理科；2.單縣中心醫院內分泌科，山東菏澤 274300）

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是女性常見生殖器疾病，既往臨床對EC的分類多是根據病理組織形態來進行，但存在明顯的主觀性，而且重復性不強，在臨床指導與預后評估中作用有限[1]。隨著臨床研究不斷深入，腫瘤基因組圖譜（TCGA）對其進行新的分子分類，能反映腫瘤預后，為臨床提供更多指導。不過，鑒于其所需的技術要求高，難以廣泛推廣，為此研究者重點加強TCGA實驗方法的改良，力求找到更為簡單與實用的分類方法，從而更好地應用于臨床。錯配修復（MMR）蛋白是MMR基因編碼蛋白的產物，在EC發病中主要有4種參與其中，即MutL同源蛋白1（MLH1）、MutS同源蛋白2（MSH2）、減數分裂后分離蛋白2（PMS2）、MutS同源蛋白6（MSH6），其中以MLH1與PMS2結合、MSH2與MSH6結合，最終形成二聚體復合物，同時發揮相應的作用[2]。但是，MMR蛋白表達缺失可能導致一些比較嚴重的問題，其中DNA堿基錯配難以矯正便是一種情況，最終會出現微衛星短串聯重復序列改變，誘發微衛星不穩定（MSI）。免疫組化檢測MSI比較方便，且經濟快速[3]，在基層醫院也可推廣。此外，程序性死亡蛋白配體1（PD-L1）在腫瘤組織及其浸潤淋巴細胞中的表達也可為篩選免疫治療提供依據，成為研究熱點。本研究就EC患者中MMR、PD-L1表達及其意義進行了探究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年2月至2022年1月單縣中心醫院收治的75例子宮內膜癌患者進行回顧性分析。患者年齡28~87歲，平均年齡（56.28±2.35）歲；＜50歲20例，≥50歲55例；國際婦產科聯盟（FIGO）標準分期[4]：Ⅰ期60例，Ⅱ期11例，Ⅲ期3例，Ⅳ期1例；分化程度：低分化13例，中分化25例，高分化37例；浸潤深度：≥50%肌層12例，＜50%肌層63例；累及子宮下段18例，未累及子宮下段57例。本研究經單縣中心醫院醫學倫理委員會批準。診斷標準：參照《子宮內膜癌診斷與治療指南(第4版)》[5]中EC的診斷標準，經術后病理確診。納入標準：①臨床資料無缺失；②均采用免疫組化檢測MMR蛋白與PD-L1表達情況；③均為初次治療、未接受過內分泌物治療。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②妊娠期或哺乳期；③精神疾病。

1.2 檢測方法 采用免疫組化法檢測MMR蛋白及PD-L1表達情況，其中MMR蛋白相關抗體包括鼠抗人MLH1、MSH2、PMS2、MSH6單克隆抗體，均為福建邁新公司提供，而PD-L1單克隆抗體由美國Pathcom system公司提供。將石蠟切片放烤箱留夜處理，控制好箱內溫度，維持62 ℃左右；次日對石蠟切片進行脫蠟和水化處理，之后采用乙二胺四乙酸（EDTA）（德州潤昕實驗儀器有限公司，型號：60-00-4，規格：100 g/瓶）緩沖液高壓修復，并保存在室溫下，待其自然冷卻后再處理；用3%過氧化氫溶液處理，避光孵育，溫度以室溫為主，之后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（北京生物制品研究所，國藥準字S10850002，規格：1 mL/支）緩沖液沖洗；加入一抗-兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白（Genzyme Polyclonals S.A.S.，國藥準字J20130139，規格：5 mL∶25 mg）后孵育1 h，溫度為室溫；加PBS處理3次，采用Max VisionTM2/HRP（福州邁新生物技術開發公司，型號：KIT-5020，規格：18 mL/100 mL）繼續孵育，溫度為室溫，最后予以PBS處理。采用二氨基聯苯胺（DAB）（上海金穗生物科技有限公司，型號：91-95-2，規格：BR 98%）顯色，顯微鏡（日本Olympus公司，型號：IX50-12）下對染色進展進行觀察，若成功則用水沖洗，并用蘇木素（美國Sigma公司，型號：GMPIVD GHS316，規格：500 mL）復染，乙醇脫水，二甲苯（湖北成豐化工有限公司，型號1330-20-7，規格：500 g/瓶）透明，封片后待檢，經顯微鏡檢查，并進行分析。

檢查結果交由單縣中心醫院經驗豐富的兩名病理科醫師采取雙盲法獨立閱片，MMR蛋白檢查均定位于細胞核，內對照為正常間質細胞或淋巴細胞，MMR蛋白表達完整標準為MMR蛋白中4種細胞核均為棕褐色著色，若其中任何1種未出現棕褐色著色，均判斷為MMR表達缺失[6]，并根據結果進行分組，包括MMR表達缺失組與MMR表達完整組。PD-L1定位于細胞膜，其陽性對照為扁桃體組織，腫瘤細胞PD-L1陽性數按照棕黃色或黃色染色來判斷，若表達≥1%判斷為陽性，不足1%判斷為陰性[7]。

1.3 觀察指標 ①統計MMR表達缺失情況。②比較兩組患者臨床病理特征。包括年齡、分化程度、浸潤深度、子宮下段、組織學類型、脈管內癌栓、淋巴結轉移、FIGO分期。③比較兩組患者PD-L1表達水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據處理。計數資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MMR表達缺失情況分析 共計檢出MMR表達缺失20例，缺失率為26.67%，其中MLH1/PMS2配對表達缺失占比最高，見表1。

表1 MMR表達缺失情況

2.2 兩組患者臨床病理特征比較 兩組患者年齡、分化程度、浸潤深度、組織學類型比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但MMR表達完整組患者無累及子宮下段、無脈管內癌栓、無淋巴結轉移及FIGO分期為Ⅰ~Ⅱ期的患者占比高于MMR表達缺失組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者臨床病理特征比較 [例(%)]

2.3 兩組患者PD-L1表達情況比較 MMR表達缺失組患者PD-L1表達率顯著高于MMR表達完整組（P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者PD-L1表達情況比較 [例(%)]

3 討論

EC是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，該病不僅有年齡化趨勢，而且發病率也持續升高，嚴重影響身心健康，威脅生命安全[8]。隨著相關學者對分子生物學的研究不斷深入，越來越多的報道發現多聚ADP核糖聚合酶1（PARP-1）在多種惡性腫瘤組織中均有異常表達，可能與腫瘤發病機制、化療耐藥產生、疾病預后等相關。目前，關于PARP-1在子宮內膜癌中的研究與報道較少，而關于PD-1的報道則逐漸增多。PD-1經調節T細胞活性，使抗原特異性T細胞的凋亡被激活，同時還可抑制調節性T細胞的凋亡，從而在抑制免疫反應與促進自身耐受性方面起到良好的效果。PD-L1則是一類跨膜蛋白，也是免疫應發的抑制因子之一，與PD-1結合后，可促進PD-1陽性細胞的增殖減少，從而抑制細胞因子分泌，加速其凋亡。總之，PD-L1在多種惡性腫瘤中均可發揮作用，能減弱宿主對腫瘤細胞的免疫反應，從而誘導其免疫逃避。此外，PD-L1為靶點的免疫治療成為腫瘤治療新方向，在EC中是否可行，可通過檢測PD-L1表達情況來進行評估，也是比較熱門的課題。

本研究結果顯示，MMR表達完整組患者無累及子宮下段、無脈管內癌栓、無淋巴結轉移及FIGO分期為Ⅰ~Ⅱ期的患者占比高于MMR表達缺失組，MMR表達缺失組PD-L1表達率顯著高于MMR表達完整組。說明對于EC患者，測定MMR表達、PD-L1表達對臨床有益，明確MMR表達缺失，是否有PD-L1陽性情況，從而為免疫治療提供依據[9]。研究發現，EC患者MMR表達缺失率在20%左右，與本研究結果相似，主要以MLH1/PMS2配對表達缺失最常見[10]。同時，在累及子宮下段、有脈管內癌栓、有淋巴結轉移等情況下，更易發生MMR表達缺失，也更易誘發EC。PD-L1是腫瘤組織中常見的因子，大部分腫瘤體內有高表達，結合配體PD-1后，明顯抑制CD4+T細胞增殖與活化，還可下調炎癥因子水平的分泌，還能對T細胞功能產生抑制，形成免疫環境，最終導致腫瘤細胞逃脫免疫系統監控[11]。MMR表達缺失患者突變率較高，腫瘤周圍浸潤較多淋巴細胞，導致PD-L1表達陽性，為此可作為PD-L1免疫抑制的受益群體。T細胞活化是腫瘤免疫的核心，PD-1則是T細胞表面比較常見的免疫共抑制受體，表達在活化的T細胞表面，與相關配體PD-L1結合，對T細胞增殖及分化有明顯的抑制作用，導致T細胞處于無功能狀態，使得其抗腫瘤免疫反應受到抑制[12]。基于此，可從PD-1/PD-L1抑制劑方面探索來進行腫瘤藥物的研發，這類抑制劑能消除PD-1/PD-L1免疫負性調節，解除對免疫檢查點的抑制，從而恢復、促進效應T細胞特異性識別及殺滅腫瘤細胞的功能[13]。但這方面的研究缺乏大樣本的系統分析，經免疫治療后，臨床緩解率雖然有無提高，但還需進一步大樣本驗證。

綜上，MMR蛋白檢測對篩查與診斷EC有參考價值，而MMR蛋白表達異常可用于評估EC，同時分析PD-L1表達情況，可為PD-L1相關免疫治療提供依據。