lncRNA LHX5-AS1通過靶向miR-532-5p調控胃癌細胞增殖和遷移的分子機制*

田希貴，首漢瓊，魏 鋼△，張 軍，杜 超，王安銀

1.重慶市梁平區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，重慶 405200；2.陸軍軍醫(yī)大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶 400038

胃癌是一種危害人類消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，胃癌的高復發(fā)率和病死率嚴重危害人類生命健康[1]。針對癌癥的分子靶向治療具有特異性高、不良反應小的特點[2]，尋找新的分子靶點對改善胃癌患者的預后具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種非編碼的單鏈RNA分子，其表現(xiàn)為抑癌基因或癌基因的功能，調控癌癥細胞的增殖和遷移行為[3-5]。LHX5-AS1是一種新型lncRNA，由522個核苷酸組成，其在癌癥細胞中的表達和機制并不清楚。lncRNA主要通過結合微小RNA(miRNA)，降低miRNA的表達，從而調控細胞的生物學行為[6-7]。本研究通過生物信息學預測軟件發(fā)現(xiàn)LHX5-AS1可能靶向結合miR-532-5p，但LHX5-AS1與miR-532-5p在胃癌發(fā)生過程中的作用尚未闡明。本研究旨在分析LHX5-AS1在胃癌組織和細胞系中的表達情況，探討LHX5-AS1與miR-532-5p在胃癌細胞增殖和遷移中的作用及其分子機制，以期為靶向治療胃癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 人正常胃黏膜GES-1細胞與人胃癌SGC7901、HS-746T、MGC803、BGC823細胞購自中科院上海生科院細胞庫。miR-532-5p、陰性對照pcDNA質粒、miR-NC、pcDNA-LHX5-AS1質粒購自美國Dharmacon公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒及雙熒光素酶報告基因載體[野生型(WT)-LHX5-AS1和突變型(MUT)-LHX5-AS1]購自美國Promega公司。Lipofectamine 2000、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司。MTT試劑盒和Transwell小室購自上海東仁化學科技公司。一抗β-Tubulin、Axin2、cyclin D1、c-Myc、β-catenin及山羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1生物信息學技術 采用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析LHX5-AS1在胃癌組織和癌旁組織中的表達差異。采用Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫分析LHX5-AS1與miR-532-5p之間的相互作用。

1.2.2細胞培養(yǎng)及轉染 于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內，采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC7901、HS-746T、GES-1細胞，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC803、BGC823細胞。消化收集對數(shù)生長期的SGC7901細胞，鋪于12孔板，SGC7901細胞匯合度為50%左右時，根據(jù)Lipofectamine 2000轉染試劑說明書瞬時轉染陰性對照pcDNA質粒、pcDNA-LHX5-AS1質粒至SGC7901細胞，分別為對照組和LHX5-AS1組。各組于轉染4 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.3qRT-PCR檢測LHX5-AS1、miR-532-5p的表達水平 使用Trizol試劑提取對數(shù)生長期細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA，在PCR儀進行qRT-PCR，LHX5-AS1以GAPDH作為內參基因，miR-532-5p以U6作為內參基因。LHX5-AS1上游引物為5′-TTCTAGCTCCCCTTCGCTCT-3′，下游引物為5′-GCGCAGGTTCTAAGGTGAGT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-532-5p上游引物為5′-CGGCCATGCCTTGAGTGTA-3′，下游引物為5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH上游引物為5′-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3′，下游引物為5′-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3′。以2-ΔΔCt法分析LHX5-AS1與miR-532-5p的相對表達量。

1.2.4MTT實驗檢測SGC7901細胞增殖能力 重懸各組SGC7901細胞，以每孔100 μL的體積接種于96孔細胞培養(yǎng)板。繼續(xù)培養(yǎng)5 d，每天相同時刻進行檢測。分別加入MTT試劑(每孔30 μL)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，每孔加入130 μL二甲基亞砜，混勻搖床15 min。酶標儀設定波長490 nm，分別讀取各孔的吸光度(A490)值，代表細胞增殖能力變化。

1.2.5Transwell實驗檢測SGC7901細胞遷移能力 采用不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸各組SGC7901細胞，以每孔200 μL的體積接種Transwell上室，以每孔500 μL的體積將含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基加入Transwell下室，培養(yǎng)箱內連續(xù)培養(yǎng)24 h。采用甲醇試劑固定上室，采用1%結晶紫試劑染色，棉簽小心擦去未穿過底膜的SGC7901細胞。在倒置顯微鏡下隨機選擇6個視野，統(tǒng)計遷移的細胞數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報告基因檢測驗證LHX5-AS1與miR-532-5p之間的相互作用 將WT-LHX5-AS1和MUT-LHX5-AS1分別與miR-NC、miR-532-5p共轉染至SGC7901細胞，在培養(yǎng)箱中孵育48 h。消化收集SGC7901細胞，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，分析各組SGC7901細胞的熒光素酶活性。

1.2.7蛋白質印跡法(Western blotting)檢測Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達水平 采用蛋白裂解液提取各組SGC7901細胞總蛋白，檢測總蛋白水平后，SDS-PAGE凝膠電泳140 min，轉至聚偏氟乙烯膜，10%的脫脂牛奶封閉130 min。采用一抗稀釋液按比例稀釋一抗，加入兔抗人Axin2(1∶2 000)、cyclin D1(1∶3 000)、c-Myc(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、β-Tubulin(1∶3 000)，4 ℃孵育15 h。采用二抗稀釋液按比例稀釋二抗，加入羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育4 h。滴加電化學發(fā)光液，在凝膠成像儀中顯影和定影。

2 結 果

2.1LHX5-AS1在胃癌組織和細胞中的表達水平 GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示，與癌旁組織相比，LHX5-AS1在胃癌組織中的表達水平明顯下降(P<0.01)，見圖1。qRT-PCR檢測顯示，LHX5-AS1在人胃癌SGC7901、HS-746T、MGC803、BGC823細胞和人正常胃黏膜GES-1細胞中的表達水平分別為0.27±0.06、0.72±0.03、0.50±0.05、0.57±0.11和1.04±0.08。與GES-1細胞比較，人胃癌細胞中LHX5-AS1表達水平均明顯降低(P<0.05)，其中LHX5-AS1表達水平降低最明顯的是SGC7901細胞(P<0.01)，見圖2。

注：與癌旁組織比較，**P<0.01。

注：與GES-1細胞比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2轉染pcDNA-LHX5-AS1質粒對SGC7901細胞中LHX5-AS1表達水平的影響 qRT-PCR檢測顯示，LHX5-AS1組SGC7901細胞中LHX5-AS1表達水平為11.89±1.29，明顯高于對照組SGC7901細胞的1.23±0.40(P<0.01)，提示轉染成功。

2.3上調LHX5-AS1表達水平對SGC7901細胞增殖能力的影響 MTT檢測結果顯示，LHX5-AS1組SGC7901細胞A490在第2、3、4、5天均明顯低于對照組(P<0.05)，見圖3。

注：與相同時間點LHX5-AS1比較，*P<0.05。

2.4上調LHX5-AS1表達水平對SGC7901細胞遷移能力的影響 Transwell遷移實驗結果顯示，LHX5-AS1組和對照組SGC7901細胞遷移數(shù)分別為(52.30±14.12)個和(161.90±13.93)個，LHX5-AS1組明顯低于對照組(P<0.01)，見圖4。

注：A為Transwell遷移實驗定量結果，與對照組比較，**P<0.01；B為Transwell遷移實驗穿膠細胞圖(100×，結晶紫染色)。

2.5生物信息學技術預測LHX5-AS1與miR-532-5p之間的相互作用 Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫預測顯示，WT-LHX5-AS1可能與miR-532-5p存在結合位點序列，見圖5。

圖5 LHX5-AS1含有與miR-532-5p互補的核苷酸序列

2.6雙熒光素酶報告基因檢測驗證LHX5-AS1與miR-532-5p之間的相互作用 雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，轉染了WT-LHX5-AS1和miR-532-5p 的SGC7901細胞熒光素酶活性較轉染了WT-LHX5-AS1和miR-NC的SGC7901細胞明顯降低(P<0.01)，見圖6。

注：與miR-NC組比較，**P<0.01。

2.7上調LHX5-AS1表達水平對miR-532-5p表達水平的調控作用 qRT-PCR檢測結果顯示，LHX5-AS1組、對照組SGC7901細胞中miR-532-5p表達水平分別為1.16±0.20、5.09±0.72，LHX5-AS1組明顯低于對照組(P<0.01)。

2.8上調LHX5-AS1表達水平對SGC7901細胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達水平的影響 Western blotting檢測結果顯示，LHX5-AS1組Wnt/β-catenin信號通路蛋白Axin2、cyclin D1、c-Myc、β-catenin表達水平較對照組均降低(P<0.01)。見圖7。

圖7 上調LHX5-AS1表達水平對SGC7901細胞Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達水平的影響

3 討 論

lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ在細胞中的轉錄產物，其能夠在轉錄水平及轉錄后水平調節(jié)基因的表達[8-9]。有研究報道，lncRNA在癌癥組織中異常表達，與癌癥的惡性程度和患者的預后密切相關，可能成為癌癥的分子治療靶點和預后標志物[10-12]。lncRNA在胃癌中的作用成為研究熱點，如ADAMTS9-AS2在胃癌組織和順鉑抗性的胃癌細胞中低表達，ADAMTS9-AS2過表達通過靶向miR-223-3p抑制胃癌細胞的活力和運動性，觸發(fā)順鉑處理后的細胞焦亡[13]；如FAM230B在胃癌細胞系中高表達且定位于細胞質，F(xiàn)AM230B過表達能夠下調miR-27a-5p表達，促進胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲并抑制細胞凋亡[14]；如LINC00659在胃癌組織中表達水平上調，與胃癌分期和淋巴結轉移密切相關，與患者年齡、性別和組織分化無關，LINC00659低表達患者的總生存期較高[15]。目前LHX5-AS1在胃癌中表達及對胃癌進展的作用機制并不清楚。

本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示，LHX5-AS1在胃癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織(P<0.01)，且qRT-PCR檢測結果顯示，LHX5-AS1在人胃癌細胞中的表達水平明顯低于人正常胃黏膜細胞(P<0.05)，提示LHX5-AS1可能在胃癌的發(fā)生過程中起到抑癌基因作用。本研究進一步顯示，MTT檢測結果顯示，LHX5-AS1組SGC7901細胞A490在第2、3、4、5天均明顯低于對照組(P<0.05)；Transwell遷移實驗結果顯示，LHX5-AS1組SGC7901細胞遷移數(shù)明顯低于對照組(P<0.01)，表明上調LHX5-AS1表達水平可降低胃癌SGC7901細胞的增殖和遷移能力，進而抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫預測顯示，LHX5-AS1可能互補結合miR-532-5p。miR-532-5p在乳腺癌、結直腸癌等組織及細胞中高表達，相關研究表明抑制miR-532-5p表達后可降低癌癥細胞的增殖及遷移能力[16-17]。研究報道，miR-532-5p表達水平降低能夠抑制胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲、細胞周期，促進胃癌細胞的凋亡，miR-532-5p在胃癌發(fā)生過程中起到癌基因的作用[18-19]。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，轉染了WT-LHX5-AS1和miR-532-5p的SGC7901細胞熒光素酶活性較轉染了WT-LHX5-AS1和miR-NC的SGC7901細胞明顯降低(P<0.01)，證實WT-LHX5-AS1可靶向結合miR-532-5p，且qRT-PCR檢測結果顯示，上調LHX5-AS1表達水平后，胃癌SGC7901細胞中miR-532-5p表達水平明顯下下降，說明LHX5-AS1能夠直接負性調控miR-532-5p的表達水平。Wnt/β-catenin信號通路在胃癌發(fā)展過程中被異常激活，并促進胃癌的生長和惡性轉化[20]。本研究顯示，LHX5-AS1負性調控miR-532-5p表達水平后，Wnt/β-catenin信號通路蛋白Axin2、cyclin D1、c-Myc、β-catenin表達水平降低，說明Wnt/β-catenin信號通路激活受到抑制。

綜上所述，LHX5-AS1在胃癌組織和細胞中呈低表達，其能夠抑制胃癌SGC7901細胞的增殖及遷移，其分子機制可能與靶向負調控miR-532-5p表達有關，LHX5-AS1可能為胃癌的防治提供新的分子靶點。