樂兒康糖漿的質量控制

張毅，王仲，楊貴生

(1.武漢市第四醫院、華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院藥學部，武漢 430034；2.武漢華夏理工學院生物與制藥工程學院，武漢 430070)

樂兒康糖漿由太子參、桑枝、黃芪、黨參、山藥、麥冬、制何首烏、大棗等13味中藥組成，用于食欲不振、面黃、身瘦等脾胃氣虛、厭食及營養不良癥的治療[1]。臨床研究表明，樂兒康制劑能明顯改善小兒食欲差、多汗、夜驚、煩躁、睡眠不安、體質量增加緩慢等癥狀[2]；能夠提高患兒免疫球蛋白水平，改善反復性呼吸道疾病患兒免疫功能，增強機體抗病能力，降低呼吸道感染發生率[3]。中藥及其制劑是多成分的集合體，各種成分具有不同的化學性質和藥理作用，相互協調、相互制約，最終達到臨床的治療效果，多指標成分控制模式近年來已廣泛應用于中藥及其制劑的質量控制中[4-5]。樂兒康糖漿現行質量標準[1]單一成分質量控制難以全面反映其整體質量，筆者暫未檢索到對該制劑多成分質量控制的文獻報道，為全面評價樂兒康糖漿的整體質量，在本實驗采用高效液相色譜(HPLC)梯度洗脫法對樂兒康糖漿中太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量進行同時測定，同時采用SPSS 26.0 版軟件對多組分含量測定結果進行聚類分析和主成分分析，有利于指導藥品生產企業不斷改進生產工藝過程控制，穩定原藥材產地來源，最終達到產品質量穩定性和臨床療效的一致性。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀，配備SPD-10AVP可變波長紫外檢測器(日本Shimadzu公司)；BT-25S型電子天平(德國Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Agilent TC-C18色譜柱(美國Agilent公司)。

1.2試藥 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號：111920-201907，含量：96.8%，中國食品藥品檢定研究院)；太子參環肽B對照品(批號：18031328，含量：99.9%)、桑皮苷A對照品(批號：17060822，含量：99.5%)購自上海同田生物技術股份有限公司；芒柄花苷對照品(批號：PRF8081121，含量：99.6%)、芒柄花素對照品(批號：PRF8091225，含量：99.9%)、桑辛素對照品(批號：14030714，含量：99.6%)均購自成都普瑞法科技開發有限公司；二氫桑色素對照品(批號：CFS201802，含量：98.0%)、桑辛素M對照品(批號：CFS201801，含量：98.0%)均購自武漢天植生物技術有限公司；乙腈為色譜純(德國Merck公司)，其他試劑為分析純；樂兒康糖漿(規格：每瓶裝100 mL；批號：20181202，20190101，20190201，20190301，20190501，20190901，20190902，編號：S1～S7，購自長春英平藥業有限公司；批號：190203，190401，200102，編號：S8～S10，購自通藥制藥集團股份有限公司)。

2 方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1對照品貯備液及混合對照品溶液 精密稱取太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素對照品適量，用甲醇制成濃度分別為0.172，0.438，0.374，0.152，0.528，0.342，0.994和0.236 mg·mL-1混合對照品貯備液；精密量取混合對照品貯備液2.5 mL，置50 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，制成濃度分別為8.6，21.9，18.7，7.6，26.4，17.1，49.7和11.8 μg·mL-1混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液及陰性樣品溶液 精密量取樂兒康糖漿5.0 mL，置25 mL量瓶，用甲醇稀釋至刻度，經孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，制得樂兒康糖漿供試品溶液；按《中華人民共和國藥典》2015年版一部中樂兒康糖漿質量標準項下的處方工藝，分別制備缺太子參、缺桑枝、缺黃芪的陰性樣品，再上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2色譜條件及專屬性實驗 Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫25 ℃；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～9.0 min，38.0%A；9.0～14.0 min，38.0%A～46.0%A；14.0～23.0 min，46.0%A～55.0%A；23.0～37.0 min，55.0%A～72.0%A；37.0～44.0 min，72.0%A～80.0%A；44.0～50.0 min，80.0%A～38.0%A)，流速0.8 mL·min-1；進樣量10 μL；檢測波長分別為203 nm[6-7](0～14.0 min檢測太子參環肽B)、305 nm[8-9](14.0～23.0 min檢測桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素)和254 nm[10-11](23.0～50.0 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素)。精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液及“2.1.2”項下各溶液依法進樣檢測，色譜圖見圖1。由此可知，在與混合對照品色譜圖中8種成分色譜峰的相應保留時間處，供試品色譜圖中太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素色譜峰峰形對稱，分離度均>1.5，理論板數按各成分色譜峰計均≥4500；太子參陰性樣品色譜圖中未見太子參環肽B色譜峰，桑枝陰性樣品色譜圖中未見桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素和桑辛素色譜峰，黃芪陰性樣品色譜圖中未見毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素色譜峰，表明陰性樣品對樂兒康糖漿中8種成分的同時測定無干擾，該方法專屬性良好。

2.3線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項混合對照品貯備液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分別用甲醇稀釋至20 mL，在“2.2”項色譜條件下依次進樣檢測太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面積，以質量濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標進行回歸，結果見表1。表明太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素在各自范圍內線性關系良好。

表1 8種成分的線性關系

2.4精密度實驗、重復性實驗、穩定性實驗 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，連續進樣6次，測得太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素峰面積RSD分別為1.21%，1.08%，1.10%，1.33%，0.85%，0.99%，0.62%和1.14%。

按“2.1.2”項下方法平行制備同一批次樂兒康糖漿樣品6份供試品溶液，依法進樣測定太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面積，計算得8種成分含量的RSD分別為1.74%，1.59%，1.63%，0.87%，1.32%，1.71%，1.06%和1.54%。

取臨用新配的同一份樂兒康糖漿供試品溶液，于制備后0，2，4，6，12，18 h進樣檢測太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面積，結果樂兒康糖漿供試品溶液18 h內穩定，8種成分峰面積的RSD分別為1.20%，1.06%，1.14%，1.35%，0.89%，1.01%，0.59%和1.11%。

2.5加樣回收率實驗 取8種成分含量已知的同一批次樂兒康糖漿樣品適量，精密量取2.5 mL，共9份，置25 mL量瓶，按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部要求分別精密加入根據8種成分含量另行配制的混合對照品溶液(太子參環肽B 0.118 mg·mL-1、桑皮苷A0.292 mg·mL-1、桑辛素M 0.206 mg·mL-1、二氫桑色素0.084 mg·mL-1、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.346 mg·mL-1、芒柄花苷0.242 mg·mL-1、芒柄花素0.654 mg·mL-1和桑辛素0.172 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5 mL各3份，使各成分對照品加入量約為樣品含量的50%，100%和150%，再按“2.1.2”項方法制成加樣供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣檢測太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的峰面積，計算8種成分的含量，結果8種成分的平均加樣回收率分別為98.51%，99.38%，97.72%，96.96%，98.70%，97.91%，100.08%和99.03%，RSD分別為1.15%，0.92%，1.36%，1.25%，1.47%，1.12%，0.76%和0.83%。

2.6含量測定 取樂兒康糖漿樣品10批，按“2.2.2”項方法制備樣品溶液(每批制備樣品溶液3份)，在上述色譜條件下進樣檢測，采用外標法計算太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素的含量，檢測結果見表2。

表2 樂兒康糖漿中8種成分含量測定結果

2.7基于化學計量學的樂兒康糖漿質量分析

2.7.1聚類分析 以10批樂兒康糖漿中太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量為變量，采用SPSS 26.0版軟件組間聯接系統聚類方法，以歐氏距離為測量區間進行聚類分析，考察不同廠家樂兒康糖漿的含量差異，聚類分析結果見圖2。結果顯示，當類間距離為15時，10批樂兒康糖漿樣品聚為2類，S4、S6、S1、S7、S2、S5和S3聚為第Ⅰ類；S8、S10和S9聚為第Ⅱ類。

圖2 10批樂兒康糖漿聚類分析圖

2.7.2主成分分析 將10批樂兒康糖漿中太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量測定結果導入SPSS 26.0版軟件，進行主成分分析，計算特征值和方差貢獻率，得到特征值和方差貢獻率(表3)、主成分分析碎石圖(圖3)。以特征值>1為標準，得到2個主成分的累積方差貢獻率為88.113%，大于85%，表明主成分1～2是影響樂兒康糖漿質量評價的主要因子。

圖3 主成分分析碎石圖

表3 特征值和方差貢獻率

3 討論

3.1成分選擇 黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素等黃酮類以及黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ等皂苷類為其主要活性成分；太子參為石竹科植物孩兒參的干燥塊根，太子參環肽B、太子參環肽A等環肽類為其特征性處分；桑枝為?？浦参锷５母稍锬壑?，主要含有多酚類、生物堿類成分，其中桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、桑辛素等為其多酚類代表性成分。同時考慮到黃芪皂苷類化合物沒有紫外吸收或只在200 nm處有微弱吸收，常規的樣品處理方法難以確保檢測結果的準確性，且黃芪皂苷種類較多，紫外檢測器難以有效分離，本實驗參考中藥標志物確認原則，選取君藥黃芪所含活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素，臣藥太子參特征成分太子參環肽B，佐藥桑枝的代表性成分桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素和桑辛素為定量測定目標成分，為全面評價樂兒康糖漿的整體質量提供支持。

3.2流動相選擇 本實驗考慮到甲醇存在末端吸收，首先選用乙腈-水[6-7，11]流動相體系進行梯度洗脫同時檢測樂兒康糖漿中的太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素，結果發現基線漂移嚴重，檢測用時較長，部分色譜峰對稱度不佳。考慮加入酸溶液加以糾正和改善，進而對乙腈-0.1%醋酸溶液[8]、乙腈-0.1%磷酸溶液[9]和乙腈-0.1%甲酸溶液[10]3個系統進行了考察。結果顯示以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相系統時，色譜圖基線平移，供試品中8種待測成分峰形對稱，與相鄰色譜峰能夠達到有效分離。故采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相按照正文“2.2”項下流動相比例對樂兒康糖漿中太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量進行同時測定。

筆者在本實驗采用HPLC梯度洗脫法對樂兒康糖漿中太子參環肽B、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和桑辛素含量進行了同時測定，建立了樂兒康糖漿多指標成分質量控制方法，所建立的方法簡便快捷，準確度高，專屬性強，能夠為全面評價樂兒康糖漿整體質量提供參考依據。從8種成分含量檢測結果及化學計量學分析結果來看，同一廠家生產的樂兒康糖漿產品質量差異較小，不同廠家樂兒康糖漿產品質量存在一定差異，可能與樂兒康糖漿制劑生產過程控制參數以及原藥材產地、采收季節等差異有關，需引起生產企業關注，同時也表明建立多成分質量控制模式對確保中成藥復方制劑質量穩定性和臨床療效的一致性具有重要意義。