藥用植物厚樸TRAP 標記的開發和利用

李落葉，鄧 苗，黃少彬，李 樨，楊童童，柯碧英

（廣東生態工程職業學院生態工程學院，廣東 廣州 510520）

【研究意義】厚樸（Magnolia off icinalis）是我國特有的珍貴藥用植物，主產于四川、湖北、浙江，在江西、湖南、廣東、廣西、貴州、陜西、甘肅等地也有分布。厚樸主要以干皮、根皮、枝皮入藥，具有燥濕消痰、下氣除滿的作用，主治濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳等，是200 多種中成藥的主要配方原料［1］，市場需求旺盛。由于厚樸野生資源消耗殆盡，當前藥材市場上的厚樸主要來源于人工藥源林，藥材質量因種源、生境及樹齡等不同而參差不齊，藥材品質難以得到保證。據報道，厚樸藥材有效成分含量與地理種源顯著相關，不同種源的藥效成分含量差異大［2］，其有效成分含量主要由遺傳因素決定［3］。因此，鑒定厚樸種源，選育、推廣優良的厚樸品種是保證藥材質量的基礎。【前人研究進展】隨著分子生物學技術的發展，分子標記技術已被廣泛用于重要性狀基因標記定位、種源或種子純度鑒定、遺傳多樣性分析、品種指紋圖譜繪制、分子標記輔助育種等方面［4-6］。中藥材方面，SSR、RAPD、RFLP 等標記技術已經用于甄別中藥材真偽、正品與替代品，用于中藥材遺傳多樣性鑒定、產地鑒別、年限鑒別、品種與雜交種質純度鑒定以及分子標記輔助育種等方面［7-8］。有關厚樸分子標記的應用已有報道，比如利用AFLP 進行厚樸遺傳背景分析，利用RAPD 鑒別厚樸偽品，利用SRAP 標記構建厚樸種質資源指紋圖譜［9］，但這些標記技術存在步驟繁瑣、技術要求高，或穩定性和重復性差等問題。近幾年開發了穩定性好、操作相對簡便的厚樸SSR 標記［10-11］，但是可用的SSR 標記數量太少。【本研究切入點】總的來說，厚樸分子標記研究不多，可利用的分子標記少，難以滿足需要。TRAP 是一種基于已知cDNA 或EST 序列信息的PCR 標記，是以已知cDNA 或EST 序列設計一條固定引物，和另一條隨機引物配對使用，進行PCR 反應后在不同品種或個體間表現出不同帶型的過程，是控制表型差異的目標基因區多態性的表現。TRAP 標記具有簡單、高效、多態性高、重復性好等優點［12］。目前，對于厚樸的遺傳背景了解很少，更沒有全基因組序列信息可用，但楊旭等對厚樸根皮、莖皮和葉的轉錄組進行了測序分析，并公布了相關cDNA 序列信息［10］，這為開發厚樸TRAP 標記提供了方便。【擬解決的關鍵問題】本研究首次利用厚樸cDNA 序列設計開發厚樸TRAP 標記，并用TRAP 標記聯合厚樸SSR 標記，對廣東樂昌龍山林場保存的厚樸進行遺傳多樣分析，構建了它們之間的親緣關系樹狀圖，為后續開展厚樸優株鑒別、優良品種選育奠定基礎，為厚樸種質資源的保護和利用提供支持，有利于促進厚樸產業健康發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

厚樸葉片于2020 年10 月采自廣東樂昌龍山林場，種源來自江西省各地，共采集了14 株厚樸樹的無病嫩葉，包括 L1、L8、L11、L12、L14、L15、L19 等7 株母樹和Ls1、Ls8、Ls11、Ls12、Ls14、Ls15、Ls19 等7 株子代，葉片用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 厚樸基因組DNA 提取

利用離心柱型植物基因組DNA 提取試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）提取厚樸基因組DNA。剪取約100 mg 葉片，在液氮中快速研磨成粉狀后，轉移至1.5 mL 滅菌離心管中，然后按照試劑盒說明書進行提取DNA，最后溶于100 μL TE buffer 中。

用核酸定量儀（Thermo Scientific ? NanoDrop ?One）檢測各樣品DNA 的濃度和質量，根據測定結果，用TE 將各樣品DNA 的濃度調至50 ng/μL，-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 厚樸種群遺傳多樣性分析

1.3.1 TRAP 標記分析（1）固定引物設計：從公共數據庫GenBank 下載厚樸cDNA 序列，用cDNA 序列在NCBI 網站（National Center for Biotechnology Information Search database,https://www.ncbi.nlm.nih.gov）進行Primer BLAST 搜索，主要參數設置：長度18～20 bp，退火溫度50～60 ℃。每段cDNA 合成1 條固定引物。

（2）隨機引物設計：與SRAP 引物相同，針對啟動子或內含子中富含AT 核心區的任意序列設計，本研究采用SRAP 隨機引物em1～em5，引物序列如下［13］：

em1:5' GACTGCGTACGAATTAAT 3'

em2:5' GACTGCGTACGAATTTGC 3'

em3:5' GACTGCGTACGAATTGAC 3'

em4:5' GACTGCGTACGAATTTGA 3'

em5:5' GACTGCGTACGAATTAAC 3'

所有引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

（3）TRAP 標記擴增條件：反應體系共20 μL，包括10 μL 的2×Ex Taq Premix（Takara 公司生產），1 μL 固定引物（10 μmol/L），0.2 μL隨機引物（10 μmol/L），1 μL 厚樸基因組DNA（50 ng/μL）和7.8 μLddH2O。

PCR 反應程序參考馮俊彥等［14］的方法略有改動：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s、40 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，5 個循環；94 ℃變性45 s、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，35 個循環；72 ℃延伸7 min。PCR 儀為BIO-RAD S1000 Thermal Cycler。

（4）PCR 產物電泳檢測：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳。每個擴增產物加入5.0 μL 上樣緩沖液（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），混勻；用微量進樣器取3.0 μL 在3%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，分子量標記為100 bp Ladder marker（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）。以1× TBE為電泳緩沖液，100 V 電壓電泳60 min。DYY-Ⅲ型垂直電泳系統為北京市六一儀器廠產品。電泳結束后，取出凝膠在蒸餾水中漂洗1 min，重復2次，再轉入0.1% AgNO3溶液中染色10 min，然后用蒸餾水漂洗2 次，最后用顯影液適度著色后轉入蒸餾水中。

1.3.2 SSR 標記分析（1）引物：參考麥靜［11］的研究，選擇多態性較好的來自厚樸及其近緣種共13 對SSR 引物，引物序列信息見表1。

表1 SSR 引物序列Table 1 Sequences of SSR primers

（2）SSR 標記擴增條件：反應體系共25 μL，包括12.5 μL 的2×Ex Taq Premix（Takara 公司生產），1 μL 正向引物（10 μmol/L），1 μL 反向引物（10 μmol/L），1 μL 厚樸基因組DNA（50 ng/μL）和9.5 μL ddH2O。

PCR 反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 1 min，35個循環；最后72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。

PCR 儀為BIO-RAD S1000 Thermal Cycler。

（3）PCR 產物電泳檢測：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體方法與1.3.1（4）的檢測方法相同。

1.4 數據分析

采用二進位制記錄TRAP 標記和SSR 標記的擴增產物中1 kb 以內清晰的電泳條帶，在相同遷移率處有帶的記為1，無帶的記為0，按照NTSYSpc2.10e 軟件要求的格式，將結果記錄在Excel 表中，利用NTSYSpc2.10e 進行統計及聚類分析。

2 結果與分析

2.1 TRAP 引物開發

根據厚樸cDNA 序列信息，共設計了14 條固定引物（表2），分別與em1～dm5 共5 條隨機引物組對，獲得70 對引物。經過初篩后，獲得T1-em2、T3-em2、T4-em1、T6-em3、T6-em4、T11-em5 和T12-em5 共7 對擴增條帶清晰、多態性好的引物，用于厚樸材料遺傳多樣性分析（圖1）。

圖1 部分TRAP 標記對14 個厚樸材料基因組DNA的擴增產物電泳結果Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of genomic DNA of 14 Magnolia off icinalis materials from partial TRAP molecular markers

表2 TRAP 固定引物序列及其來源Table 2 Sequences and sources of fixed primers of TRAP

2.2 SSR 標記分析

參加測試的13 對SSR 引物在所有被檢測的厚樸材料中都能擴增出清晰條帶，其中2 對引物（Stm0246 和M10D8）表現出多態性（圖2），可用于本研究厚樸材料遺傳分析。

圖2 SSR 引物對14 個厚樸材料基因組DNA的擴增產物電泳結果Fig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of genomic DNA of 14 Magnolia off icinalis materials from SSR molecular markers

2.3 廣東樂昌龍山林場厚樸遺傳多樣性分析

本研究設計并篩選出擴增條帶清晰、多態性良好的7 對TRAP 引物和2 對SSR 引物，分別擴增厚樸單株基因組DNA，擴增產物的電泳條帶經判讀后轉化為數據記錄在Excel 表中，用NTSYSpc2.10e 軟件進行聚類分析，構建了龍山林場厚樸資源的親緣關系樹狀圖。結果（圖3）顯示，龍山林場厚樸資源遺傳相似系數在0.75～0.88 之間，遺傳相似系數為0.75 時，厚樸母株被分成兩大類，第一類包括L1、L8、L12、L14，第二類包括L11、L15、L19。母株與對應子代在聚類圖上并未表現出相對更高的遺傳相似性，親子之間甚至相距較遠，如L14 與LS14 存在較大遺傳差異，這可能與厚樸的繁殖特性有關。厚樸自交不結實，種子基本都是雜交種［15］，且后代在親緣關系上更偏向父本［11］，群體內基因交流頻繁，因此較好地保留了厚樸的遺傳多樣性，這對厚樸良種選育有利。

圖3 基于TRAP 和SSR 標記分析的14 個厚樸材料的親緣關系樹狀圖Fig.3 Phylogenetic tree of 14 Magnolia off icinalis plants based on TRAP and SSR molecular marker

3 討論

本研究利用公共數據庫GenBank 中厚樸cDNA 序列設計了TRAP 引物，分別與SRAP 隨機引物配對，共開發出擴增產物電泳條帶清晰、帶型豐富、多態性好的厚樸TRAP 標記7 個，并從已知的厚樸SSR 標記中篩選到2 個有用的SSR 標記。利用這9 個分子標記分析了廣東樂昌龍山林場厚樸資源的親緣關系，明確了各單株之間的相似系數。開發的新標記將為后續進行厚樸種植資源鑒定、優株鑒別、分子標記輔助選擇提供工具，為優良品種選育奠定基礎。

選育、培植優良厚樸品種是保證厚樸藥材質量的基礎。在新品種選育方面，由于厚樸生長周期長，從定植到采收需要15 年以上［16］，利用藥效成分、生長特性、產量等性狀篩選優良種質時間周期太長、效率太低。因此，迫切需要改進鑒定方法，加快良種選育進程。分子標記輔助育種在很多植物上已取得成功并應用成熟［17-19］，但厚樸分子標記研究相對滯后，雖然有將RAPD［3］、AFLP［20］和SSR［10］標記用于厚樸遺傳多樣性、藥材道地性分析，但可供選擇使用的標記數量非常有限。

在探討種源的親緣關系或進行種質資源鑒定時，開發TRAP 標記是方便、經濟、有效的辦法。如劉嘉霖等［21］成功開發TRAP 標記對黃淮海和南方大豆品種進行遺傳結構和多樣性分析，明確了大豆品種分布與地域無明顯相關；索相敏等［22］開發TRAP 標記分析了蘋果屬種間遺傳多樣性。TRAP 標記是控制表型差異的目標基因區多態性的表現［20］，利用厚樸cDNA 序列開發的TRAP標記將更加適合用于對我們所關注的表型進行鑒別和多樣性分析。本研究率先開發出厚樸TRAP標記，并利用其對厚樸資源進行了遺傳多樣性分析，結果發現母樹與子代并未成對出現在親緣關系樹狀圖中，母子遺傳相似系數不高，這與“厚樸自交不結實，種子基本都是雜交種［15］”、“后代在親緣關系上更偏向父本［11］”等觀點一致。

在SSR 引物篩選過程中，發現對浙江、湖南等地厚樸材料表現良好多態性的13對SSR引物［11］在本研究材料中多態性比較低，只有其中的2 對SSR 引物表現出多態性。說明來自不同地區的厚樸資源遺傳背景差異較大，用一個地區厚樸材料開發出的分子標記可能不適合其他地區的厚樸資源，同時也表明不同地理種源的厚樸可能具有不同的遺傳背景和品質特征，這對厚樸優良品種選育有利，也對厚樸種質資源保護具有指導意義。

4 結論

本研究設計、開發了7 個厚樸新型TRAP 標記，并篩選到2 個厚樸SSR 標記。利用新開發的TRAP 分子標記和SSR 標記分析了廣東樂昌龍山林場厚樸資源的遺傳多樣性，構建了厚樸資源的親緣關系樹狀圖，各單株之間的遺傳相似系數在0.75～0.88 之間，母株與對應子代在聚類圖上并未表現出更高的遺傳相似性，為厚樸子代是雜交種且遺傳上更偏向父本提供了佐證，進一步證明厚樸種群內基因交流頻繁，遺傳多樣性豐富，為厚樸良種選育提供理論依據。新型分子標記的不斷開發利用，必將促進厚樸優株鑒別、優良品種選育、分子標記輔助選擇等研究工作的更快發展。