乙型肝炎肝硬化患者外周血IL?6 水平與肝功能、HBV?DNA 載量及感染幽門螺桿菌的相關(guān)性研究

白瑞，鮑中英，王碩，姜敏，郭楊志

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是肝臟疾病一大重要因素，可導(dǎo)致慢性肝病、肝硬化、肝細(xì)胞癌和與肝臟相關(guān)的死亡等，已成為重大的全球公共衛(wèi)生問題。盡管HBV 疫苗已廣泛接種，但其感染率仍然較高［1］。乙型肝炎病毒的脫氧核糖核酸（HBV?DNA）載量是反映HBV 活躍程度的指標(biāo)，可作為HBV 感染的臨床診斷依據(jù)及反映療效程度。HBV?DNA 水平升高是慢性乙型肝炎患者發(fā)展為肝硬化的危險因素［2］。乙型肝炎被認(rèn)為肝細(xì)胞存在炎癥，而作為參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，白細(xì)胞介素?6（interleukin 6，IL?6）在乙型肝炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。HBV 感染患者機(jī)體內(nèi)的T細(xì)胞亞群失衡產(chǎn)生并釋放促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)IL?6激活炎癥信號通路，引起肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)慢性乙型肝炎進(jìn)展，產(chǎn)生肝慢性纖維化，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化。國內(nèi)外研究顯示，IL?6 在不同肝臟疾病中的水平具有差異，在HBV 感染過程中扮演著重要作用，然而其感染機(jī)制尚不清楚［3-4］。幽門螺桿菌（Helico?bacter pylori，HP）常見于胃黏膜上皮細(xì)胞，是導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍、胃癌的主要原因之一。然而近些年研究報道稱，HP 感染可能與肝臟疾病有關(guān)，與HBV共同促進(jìn)乙型肝炎患者肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)生和發(fā)展［5-6］。本研究回顧性分析了乙型肝炎肝硬化患者IL?6 水平、HBV?DNA 載量及感染HP 的情況，探討IL?6 參與乙型肝炎肝硬化的可能機(jī)制。報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院2017 年6 月至2021 年6 月收治的126 例乙型肝炎肝硬化患者作為研究組，其中男性71 例，女性55 例，年齡21～72 歲［（48.62 ± 12.36）歲］，Child?Pugh 分級［7］：A 級31 例、B 級60 例、C 級35 例。選取同期接受體檢的60 例健康人作為對照組，其中男性33 例，女性27 例，年齡22～70 歲［（47.13±11.88）歲］，2 組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究設(shè)計符合《赫爾辛基宣言》。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合中華醫(yī)學(xué)會制定的乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)確診為肝硬化［8］；（2）近1 個月內(nèi)未使用抗菌、抗病毒治療；（3）病歷資料完整；（4）所有患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他感染性疾病；（2）合并其他原因所致的肝硬化；（3）合并惡性腫瘤；（4）合并自身免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 方法 （1）IL?6 水平檢測。患者入院時采集空腹外周靜脈血5 ml，以離心半徑為10 cm、轉(zhuǎn)速為3 000 r/min 離心15 min，收集上清液待測。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL?6 水平，試劑盒購于美國R&D systems 公司。（2）肝功能測定。患者入院時采集空腹外周靜脈血5 ml，以離心半徑為10 cm、轉(zhuǎn)速為3 000 r/min 離心15 min，收集上清液待測。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）水平，使用日本日立7600 型全自動生化分析儀檢測。（3）HBV?DNA 載量檢測。患者入院時采集空腹外周靜脈血2 ml，以離心半徑為10 cm、轉(zhuǎn)速為3 000 r/min 離心15 min，收集上清液待測。采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測血清中HBV?DNA 載量，所需引物：上游引物（CCTCCT?CATCCTGCTGCT）、下游引物（AACT?GAAAGCCAAACAGTG） 、探 針 序 列（TET ?TCCCATCCCATCATCCCTGGGCTTT?TAMRA），均由上海生工生物工程股份有限公司提供，試劑盒購于廣州達(dá)安基因股份有限公司。（4）HP 感染檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血清中HP-抗體水平，試劑盒購于華美生物工程公司。HP-抗體≥100 dpm/mmol 為陽性，<100 dpm/mmol 為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 本研究所得數(shù)據(jù)均采取SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件展開分析。計數(shù)資料以百分比（%）表示，行χ2檢驗；計量資料以±s表示，行獨(dú)立樣本t檢驗。相關(guān)性采用Pearson 分析；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD?t檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝功能、IL?6、HBV?DNA 及HP 感染情況 研究組患者ALT、AST 明顯高于對照組（P<0.01），ALB 明顯低于對照組（P<0.01）；研究組患者IL?6明顯高于對照組（P<0.01）；研究組患者HBV?DNA明顯高于對照組（P<0.01）；研究組患者HP 陽性率明顯高于對照組（P<0.01）。見表1。

表1 研究組和對照組肝功能、IL?6、HBV?DNA 及HP 感染情況（± s）

表1 研究組和對照組肝功能、IL?6、HBV?DNA 及HP 感染情況（± s）

注：ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，AST 為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，ALB 為白蛋白，IL?6 為白細(xì)胞介素?6，HBV?DNA 為乙型肝炎病毒的脫氧核糖核酸，HP 為幽門螺桿菌

HP 陽性［例（%）］82（65.08）25（41.67）9.119 0.003組別研究組對照組t 值P 值例數(shù)126 60 ALT（U/L）153.12±41.65 19.74±5.32 24.679<0.001 AST（U/L）112.99±34.59 15.74±4.29 21.671<0.001 ALB（g/L）27.74±6.09 45.25±5.74 18.659<0.001 IL?6（ng/ml）42.50±29.26 9.29±4.44 8.733<0.001 HBV?DNA（IU/ml）4.92±1.78 0.00±0.00 21.358<0.001

2.2 不同Child?Pugh 分級患者肝功能、IL?6、HBV?DNA 載量及HP 感染比較 不同Child?Pugh 分級患者ALT、AST、ALB、IL?6、HBV?DNA 等比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。組間兩兩比較，C 級患者ALT、AST、IL?6、HBV?DNA 明顯高于B 級，B級患者明顯高于A 級（P<0.01）；C 級患者ALB 明顯低于B 級，B 級患者明顯低于A 級（P<0.01）。不同Child?Pugh 分級患者HP 陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同Child?Pugh 分級患者肝功能、IL?6、HBV?DNA 及HP 感染比較

2.3 IL?6 與肝功能、HBV DNA、HP 感染的相關(guān)性 Pearson 分析結(jié)果顯示，IL?6 與ALT、AST、HBV?DNA 等呈顯著正相關(guān)（r=0.606、0.645、0.549，P<0.05）；IL?6 與ALB 呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.446，P<0.05）。見圖1。IL?6 與HP 陽性呈顯著正相關(guān)（r=0.489，P<0.05）。

圖1 IL?6 與肝功能、HBV DNA 的相關(guān)性

3 討論

乙型肝炎是肝臟最常見的傳染性疾病。據(jù)報道，全球估計有2.4 億人患有慢性乙型肝炎，每年有2%～4%的患者發(fā)展為肝硬化，導(dǎo)致患者反復(fù)住院，生活質(zhì)量下降，甚至引發(fā)死亡，嚴(yán)重危害人類生命健康［9］。因此，如何有效治療、提高患者預(yù)后成為臨床首要任務(wù)，其中研究乙型肝炎肝硬化的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有利于臨床診療。

肝硬化是由復(fù)雜的細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路網(wǎng)絡(luò)調(diào)控造血干細(xì)胞的激活和纖維生成。肝纖維化是發(fā)展為肝硬化的必要途徑，多見于不同病因的慢性肝臟疾病，其形態(tài)、生理特征主要是細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積于肝組織，降低肝功能，其中細(xì)胞因子、微小核糖核酸參與肝纖維化和肝硬化的發(fā)生、發(fā)展［10］。IL?6 是一種多生物學(xué)功能細(xì)胞因子，作為炎癥介質(zhì)在免疫反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IL?6 在損傷、創(chuàng)傷、應(yīng)激、感染等因素引起的炎癥反應(yīng)中的表達(dá)量顯著上調(diào)，作為重要因素誘發(fā)和促進(jìn)慢性肝炎的發(fā)生、發(fā)展［11］。本研究結(jié)果顯示，IL?6 在乙型肝炎肝硬化患者機(jī)體中的表達(dá)量明顯高于正常人，且隨著Child?Pugh 等級增加而增多，而有學(xué)者發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化患者經(jīng)治療后IL?6 水平明顯降低。相關(guān)性分析顯示，IL?6 表達(dá)水平與肝功能呈明顯的正相關(guān)，進(jìn)一步說明IL?6 與肝硬化密切相關(guān)，原因在于IL?6 在肝細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞膜上與受體IL?6R 結(jié)合形成復(fù)合物，激活細(xì)胞NF?κB 信號傳導(dǎo)和Ras?MAPK 通路，刺激T 細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞成熟和分化，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生C 反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原等炎癥因子，誘發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷［12］。

近年來研究證明，HBV 感染是肝病的主要原因，25%～30% 的HBV 感染患者最終發(fā)展為肝硬化。HBV 首先附著在肝細(xì)胞膜上，與包膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體蛋白，隨后HBV 包膜與病毒的內(nèi)體膜內(nèi)吞和融合［13］。本研究中乙型肝炎肝硬化患者檢測出較高的HBV 載量，而對照組則無HBV 感染，提示乙型肝炎肝硬化與HBV 活性密切相關(guān)。本研究相關(guān)性分析顯示，IL?6 與HBV 感染具有顯著的正相關(guān)，原因在于當(dāng)HBV 感染后，其在肝細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，導(dǎo)致肝細(xì)胞受損，引起機(jī)體免疫應(yīng)答，激活巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，誘發(fā)免疫級聯(lián)反應(yīng)，分泌大量的IL?6，加重炎癥反應(yīng)，引起肝細(xì)胞壞死、肝功能下降，進(jìn)而激活肝星狀細(xì)胞，增加肝內(nèi)膠原合成，導(dǎo)致肝硬化［14］。有學(xué)者報道IL?6 與HBV 的復(fù)制密切相關(guān)，通過體內(nèi)、體外試驗發(fā)現(xiàn)，在IL?6 存在的微環(huán)境中，HBV 感染性增強(qiáng)，IL?6 能促進(jìn)HBV的感染［15］。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HBV 感染的患者IL?6表達(dá)水平增加，主要是因為HBV?X 蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控IL?6 基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而促進(jìn)肝炎的進(jìn)展，導(dǎo)致肝硬化［16］。因此，IL?6 與HBV 感染、復(fù)制等機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

HP 感染是臨床常見的革蘭氏陽性病原菌，主要感染部位在胃部，是導(dǎo)致各類胃部疾病的重要因素，同時也在脂肪性肝、肝炎、肝纖維化和肝硬化中發(fā)揮著重要的作用［17］。乙型肝炎肝硬化患者的肝臟組織存在HP 的DNA，影響脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪積累、變性，使肝細(xì)胞纖維化，肝纖維化后患者免疫功能不全，肝內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量減少，因此可能通過門靜脈流入肝臟的HP 不能被及時捕獲和消除，導(dǎo)致HP 免疫逃逸［18］。HP 感染會引起機(jī)體體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性抗體，對肝細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，使肝細(xì)胞變形、增生、破壞，加速肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加劇肝損傷，最終導(dǎo)致肝硬化［19］。本研究結(jié)果顯示，乙型肝炎肝硬化患者的HP 感染陽性率明顯高于對照組，不同Child?Pugh 分級之間雖有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義。IL?6 表達(dá)水平越高的患者其HP 感染陽性率越高，而相關(guān)性分析顯示，IL?6 與HP 感染呈顯著正相關(guān)，可能因為HP 感染刺激引起局部和全身促炎細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)IL?6 的釋放［20］。此外，在中醫(yī)學(xué)的學(xué)習(xí)中發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)雖無關(guān)于“肝硬化”“HBV”及“HP”的直接論述，但從傳染病角度看，無論HBV 還是HP，均有明確的傳染源、傳播途徑和易感人群，符合《瘟疫論》中記載的“疫者感天地之厲氣，此氣之來，無論老幼強(qiáng)弱，觸之即病”，屬“疫毒邪氣”范疇。而從臨床表現(xiàn)看，二者導(dǎo)致的疾病多見肝脾不和、濕熱中阻、濕毒內(nèi)停等以中焦脾胃為核心、水液代謝異常的證候類型［21-22］，故具有一定的臟腑發(fā)病相關(guān)性。這從中醫(yī)證候角度解釋了HP 與HBV 感染肝硬化的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，IL?6 在乙型肝炎患者肝硬化發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，與HBV 病毒的感染、復(fù)制密切相關(guān)，可作為HP 感染肝臟組織的重要標(biāo)志物。本研究結(jié)果與國內(nèi)外部分報道有差異，可能與本研究樣本量較少有關(guān)。因此，有待進(jìn)一步擴(kuò)大研究的樣本量及進(jìn)行體外細(xì)胞試驗、體內(nèi)動物實驗研究。