GC-MS/MS法測定白酒中8種有機磷酸酯化合物

詹重清

（福建省產品質量檢驗研究院 國家加工食品質量監督檢驗中心，福建 福州 350002）

有機磷酸酯（Organophosphate Esters，OPEs）是一種用途廣泛的添加材料，具有阻燃、潤滑、消泡、耐熱、增塑、耐腐蝕等性能，主要應用于建材、紡織、玩具、電子元器件及食品行業中[1-3]。有機磷酸酯類化合物在使用時主要是通過物理方式添加到產品中，因此，OPEs與各類材料的結合并不牢固，在使用過程中能夠通過磨損、揮發等方式擴散逃逸到環境中[4]。2011～2018年全球的有機磷酸酯使用量從50萬噸增加到280萬噸[5]，這給環境保護帶來了不小的壓力和挑戰。當前，已有報道指出在水體、大氣、室內灰塵、土壤沉積物、動植物以及人體內檢測出了相當含量的OPEs[3，6-12]，同時，也有研究指出有機磷酸酯類化合物有神經和生殖毒性，能夠致癌、干擾內分泌等[13,14]。

白酒是日常生活中一種不可或缺的飲品，有資料顯示2017～2019年中國白酒年產量均大于786萬千升[15-17]，隨著生活水平的提高，人們對白酒的安全問題也愈發關注，特別是以前容易被忽視的持久性有機污染物（POPs）所帶來的威脅。POPs并非在發酵過程中產生，而可能是由釀造過程中所使用的原材料（如含有OPEs的水體、谷物等）、所接觸的器具（如塑料的接酒桶、輸酒管、乳膠管以及包裝材料中的塑料制品等）。

雖然已有研究顯示在白酒中檢測出鄰苯二甲酸酯等塑化劑，但是目前國內外尚無有關白酒中有機磷酸酯分析檢測技術的文獻報道和標準，這使人們無法了解白酒中OPEs類持久性污染物的主要來源以及污染水平。同時，由于其在白酒中污染水平數據的極度匱乏，相關國家機關部門無法進行有效評估、制定白酒中OPEs持久性污染物含量的合理限值水平。

未來，不排除將OPEs類持久性污染物納入到我國的標準監管體系中，因此，建立白酒中的OPEs這類持久性有機污染物的分析監測方法，不僅可以監測有機磷酸酯在白酒中的含量水平以及遷移情況，保護人體健康，也有利于規范白酒生產工藝，為企業發展、政府部門監管市場提供技術支撐。

當前，對白酒中有機污染物檢測的前處理技術主要有LLE（液液萃取）、SPE（固相萃取）、UAE（超聲輔助萃取）、SPME（固相微萃取法）及QuEChERS等[18-21]，而在OPEs的檢測方法中，以配有氮磷檢測器的氣相色譜（GC-NPD）、氣相色譜串聯質譜法（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS/MS）為主[22]。相比其他三種提取方式，LLE（液液萃取）具有操作更簡便的特點在食品安全領域、環境及生物檢測等方面得到廣泛應用；在靈敏度方面，GC-MS/MS的反應監測模式較GC-MS更優良，在基質對檢測的影響方面，其電子轟擊源電離比LC-MS/MS更低，而且它還具有高分辨率、高重現性等特點。綜合以上技術方法的優劣，本研究建立了液液萃取結合GC-MS/MS檢測白酒中8種OPEs的分析方法，該方法簡便、快速、經濟。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（7890A-7000D，美國安捷倫），配EI源；HP-5 ms Ultra Inert彈性的石英毛細管柱（30 m×250μm×0.25μm，美國安捷倫）；電子天平[BSA224S型，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；48位全自動平行濃縮儀（AutoEVA-60，廈門睿科有限公司）；圓周振蕩器（IKA）；旋轉蒸發儀器（IKA）、低溫冷卻循環泵（DLSB-5/20,鄭州長城科工貿有限公司）。

8 種有機磷酸酯標準品：磷酸三正丁酯（TBP）、磷酸丁氧基乙基酯（TBEP）、磷酸三苯酯（TPP）均購自上海麥克林生化科技有限公司；磷酸三（2-氯乙基）酯（TCEP）、磷酸三鄰甲苯酯（o-TCP）、氘代磷酸三苯酯（TPP-d15）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二苯基-2-乙基己酯（EHDPP）、磷酸三間甲苯酯（m-TCP）、磷酸三對甲苯酯（p-TCP）均購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。

正己烷為分析純，購于天津市科密歐化學試劑有限公司；無水硫酸鈉、氯化鈉、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

有機濾膜（0.45μm，天津市津騰實驗設備有限公司）。白酒樣品（由福建省產品質量檢驗研究院提供）。

1.2 標準儲備液的配制

準確稱取適量TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP、p-TCP標準品于100 mL的容量瓶中，用丙酮配置成濃度為1000μg/mL標準儲備液，置4 ℃冰箱保存，使用時再逐級稀釋配成所需濃度的標準液。

稱取適量的TPP-d15標準品于100 mL容量瓶中，用丙酮配置成濃度為10μg/mL的內標溶液。

1.3 樣品前處理

分別取5 g酒樣于25 mL的離心管內，加入0.6 g氯化鈉，在渦旋振蕩器上渦旋1 min，再加入4 mL的純凈水，用5 mL乙酸乙酯進行提取，再在渦旋振蕩器上渦旋5 min，然后靜置5～10 min。吸取離心管上層乙酸乙酯到另一個10 mL試管中，并再一次用5 mL乙酸乙酯提取，合并2次的乙酸乙酯，加入0.5 g無水硫酸鈉后于渦旋振蕩器上渦旋1 min，最后在40 ℃的溫度下用小氣流的氮氣吹至1 mL以下，再用乙酸乙酯定容為1.0 mL，加入10μL的內標物（TPP-d15），待進樣檢測。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：HP-5 ms Ultra Inert（30 m×250μm×0.25 μm）；載氣：氦氣；進樣口溫度：250 ℃。

程序升溫：初始60 ℃，保持1 min；然后以40 ℃/min升溫到170 ℃，保持1 min；再以10 ℃/min升溫到310 ℃并保持5 min；色譜柱流量：1 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣。

1.4.2 質譜條件

離子源：電子轟擊離子源（EI）；離子源溫度：280 ℃；電離能量：70eV；連接線溫度：280 ℃；溶劑延遲時間：2.8 min；掃描方式：MRM。主要OPEs的質譜參數及保留時間見表1。

2 結果和討論

2.1 氣相色譜－串聯質譜條件的優化

設置成全掃描模式，調節升溫程序，實現5μg/mL混合標準品（8種有機磷酸酯化合物、1種氘代有機磷酸酯化合物）中目標物基線的良好分離，通過利用譜庫檢索功能對8種有機磷酸酯進行辨別和確定，根據已得到的8種有機磷酸酯的保留時間進一步對本實驗所需要的色譜條件進行調整和優化。全掃描模式下，將提取到的8種有機磷酸酯所具有的特征性離子作母離子，對母離子分別施加5～30 eV碰撞能量，掃描辨識具有特征性的子離子，依次調整碰撞能以篩選最適合的碰撞能值，最終確定9種有機磷酸酯的最優化的母離子對、子離子對以及最適合的碰撞能量。然后再用多反應監測掃描（MRM) 實現對有機磷酸酯類化合物的準確定量分析。9 種有機磷酸酯的多選擇反應監測信息見表1，結果表明在10 min內，9種有機磷酸酯可以全部實現良好的分離。

2.2 提取溶劑的優化

有機磷酸酯的極性范圍較大，logKow（辛醇水系數）在1.44～6.64的范圍之間（表2）。為實現對樣品的快速檢測以及確保對目標物有較好的提取效果，本研究采取液液萃取（LLE）的提取方法。

本研究對使用不同極性的正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷等有機溶劑提取白酒中8種有機磷酸酯的效果進行了評估，實驗發現按照1.4的方法進行操作，均能夠使目標物快速進行提取。圖1為3種有機溶劑對8種有機磷酸酯目標物的提取回收率的對比，從圖中可以看出，除了正己烷對TCEP的提取回收率較低外，其余2種對TCEP的提取回收率都較高。由于二氯甲烷對人體和環境有害，因此，本實驗最終選擇乙酸乙酯作為LLE萃取劑。

圖1 3種不同溶劑的提取效果

同時，實驗表明乙酸乙酯分2次提取相比1次提取可以顯著提高有機磷酸酯的回收率，而且使用乙酸乙酯作為萃取溶劑在節省溶劑用量同時還比較環保。

2.3 線性回歸方程、檢測限和定量限

在優化后的實驗條件下，本研究采用TPP-d15為內標物質，以內標法對TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP和p-TCP這8種有機磷酸酯進行定量分析。對濃度為5、10、25、50、100、250、500μg/L的標準液進行測定，以OPEs與TPP-d15的峰面積之比為縱坐標，以兩者的濃度之比建立橫坐標，進行線性回歸分析，并作標準曲線。二者的線性相關系數均大于0.998，檢出限是0.031～0.41μg/kg ，定量限是0.10～1.4μg/kg。其中，目標化合物的峰高為噪聲3倍（S/N=3）時所對應的濃度是檢測限，為噪聲10倍（S/N=10）對應的濃度是定量限。表3是所測8種有機磷酸酯的標準曲線方程、方法檢測限和定量限及相關系數。

表3 8種OPEs的標準曲線方程及其相關系數、方法檢出限和定量限

2.4 精密度、準確度和回收率

本研究中，在空白白酒樣品分別添加2.0、5.0、10.0μg/kg的3個濃度水平進行加標回收試驗，對每個濃度水平的平行試驗都進行6次，按前述1.4的操作方法進行實驗處理，表4為試驗結果。表4可知，白酒中8種有機磷酸酯的回收率和相對標準偏差分別在77.2%～96.8%和3.1%～8.9%之間，說明本實驗建立起的白酒中8種有機磷酸酯的檢測方法的準確性和穩定性都較高，可以對實際白酒樣品進行檢測。圖2為空白白酒中添加量為10μg/kg的總離子流圖。

表4 白酒中8種OPEs的回收率、相對標準偏差（n=6）

圖2 白酒中添加量為10μg/kg的總離子流圖

2.5 實際樣品的檢測

采用本方法對市場上的20份白酒樣品進行8種有機磷酸酯的檢測分析，結果顯示有機磷酸酯均未在樣品中檢出。

3 結論

本研究建立了液液萃取結合氣相色譜法－三重四極桿質譜對白酒中的8種有機磷酸酯化合物（TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP、p-TCP）進行快速檢測的分析方法，優化了方法的提取方式、萃取溶劑等檢測條件，采取內標（TPPd15）進行定量分析，減少了基質的干擾。通過對方法學評價的結果進行分析，可以了解到本研究所建立的檢測方法的準確度和精密度都較高，TBP、TCEP、TBEP、TPP、EHDPP、o-TCP、m-TCP和p-TCP的加標回收率在77.2%～96.8%之間，相對標準偏差為3.1%～8.9%，方法檢測限檢出限為0.031～0.41 μg/kg，定量限為0.10～1.4μg/kg。本實驗方法在前處理過程中操作步驟簡便、快速，同時質譜儀器分析的時間僅需10 min，適用于白酒樣品中有機磷酸酯類有機污染物的快速、準確檢測。