6-生物素氨基己酸-七葉亭合成及其生物活性評價

王佳茂 韋永華 盧易揚 李美芽 王林燕 應佳妮 蔣福升

1.浙江中醫藥大學生命科學學院 杭州 310053 2.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 3.浙江中醫藥大學中醫藥科學院

七葉亭（esculetin，ESC），又名秦皮乙素、七葉內酯，化學名稱為6，7-二羥基香豆素，是中藥秦皮的主要藥效成分之一，也是合成平喘藥東喘寧的重要中間體[1]。現代藥理學研究表明，ESC不僅具有平喘作用[2]，還具有抗炎[3]、抗氧化[4]、保肝[5]、抗癌防癌[6-7]、抑菌[8]等諸多藥理活性，并在腦缺血再灌注損傷[9-10]和肝、腎纖維化[11-12]等疾病的治療方面展現出潛在的應用價值，是近年來開發應用研究熱點天然化合物之一。現代分子藥理學研究表明，ESC對諸多信號通路具有調控作用[13-14]，但其確切的作用靶蛋白尚不清楚，這對以其為先導化合物進行結構修飾，開發活性更強的衍生物帶來了困難。

親和性蛋白組學（affinity-based protein profiling，ABPP）方法是近年發展起來的一種用于揭示小分子藥物可能的靶蛋白的有利技術方法[15]。以生物素為報告基團，通過連接臂及反應基團和小分子藥物偶聯，制備小分子藥物探針是ABPP方法中使用較為廣泛和成熟的一種。通過該方法，已經揭示了青蒿素、小檗堿、雷公藤甲素等眾多中藥活性單體成分作用的靶蛋白[16]和相關分子機制。因此，本文對6-生物素氨基己酸（6-biotinamidohexanoic acid，Bio-AHA）偶聯ESC合成條件進行優化，以制備6-生物素氨基己酸-七葉亭（6-biotinamidohexanoic acid-esculetin，Bio-AHAESC）探針，并對其抗炎和細胞保護活性進行評價，為進一步揭示中藥單體ESC的作用靶點和分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器和材料

1.1.1 主要儀器 U3000型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 系統購于美國戴安公司；C6型流式細胞儀購于美國BD公司；Enspire多功能酶標儀購于美國PerkinElmer公司；ACQUITY H-Class PLUS型超高效液相色譜儀及SYNAPT G2-Si型高分辨四級飛行時間串聯液質聯用儀均購于美國Waters公司；Magnet System 600型600 MHz核磁共振波譜儀為德國Bruker公司產品。

1.1.2 藥品和試劑 ESC購于九鼎化學（上海）科技有限公司 （批號：TWI52）；Bio-AHA購于天津希恩思生化科技有限公司（批號：1069023020）；4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）和N，N'-二環己基碳化二 亞胺（N，N'-dicyclohexyl carbodiimide，DCC）均購于上海麥克林生化科技有限公司（批號：C12072879、C11697350）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDCI]購于研峰科技（北京）有限公司（批號：SPSJH8B）；干燥（水分≤30 ppm）N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）購于安徽澤升科技有限公司（批號：92HRBRRA）；色譜純乙腈購于西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司（批號：WXBD5691V）；色譜純甲酸購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司（批號：B1912070）；細胞活力測定試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購于日本同仁化工株式會社（批號：PH632）；杜爾伯克改良伊格爾培養基 （Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）和胎牛血清均購于Gibco公司（批號：GP2011011、20151103）；BDTM小鼠炎癥因子微量樣本多指標流式陣列（cytometric bead array，CBA）分析試劑盒購于美國BD公司（批號：0325011）；其他試劑均為分析純。

1.1.3 細胞株 人肝癌細胞HepG2和小鼠單核巨噬細胞RAW264.7均購于上海中科院細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 不同反應條件對Bio-AHA-ESC合成率影響分別稱取Bio-AHA，以干燥DMF溶解，冰浴30 min后加入DCC并冰浴攪拌反應30 min，然后加入DMAP和ESC，繼續冰浴攪拌反應3 h，自然恢復室溫后繼續攪拌反應[17]。另外稱取Bio-AHA，以干燥DMF溶解，加入ESC、DMAP和EDCI，室溫攪拌反應[18]。定量取樣稀釋，進樣10 μL進行HPLC分析，考察不同催化劑、反應溫度、反應時間、Bio-AHA和ESC投料比及催化劑用量對ESC轉化率和產物產率的影響。

1.2.2 HPLC色譜條件 采用戴安UltiMateTM3000分析型HPLC系統，色譜條件為：島津Inertsil?ODS-SP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Phenomenex C18保護柱（4.0 mm×3.0 mm），柱溫25 ℃，流速1 mL·min-1，檢測波長343 nm，流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水（B），梯度洗脫：0～10 min 15%A，10～15 min 15%～25%A，15～25 min 25%A，25～30 min 25%～95%A，30～31 min 95%～15%A，31～41 min 15%A。 配制系列對倍稀釋ESC標準液，進樣10 μL，按上述色譜條件繪制ESC標準曲線：Y=862.51X-2.9645，R2=0.9998。

1.2.3 產物分離鑒定 反應結束后直接進樣UltiMate 3000半制備型HPLC系統，色譜條件為：welch Ultimate?XB-C18色譜柱 （10 mm×250 mm，10 μm），柱溫30 ℃，流速5 mL·min-1，檢測波長325 nm，流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水（B），梯度洗脫：0～3 min 20%A，3～11 min 20%～80%A，11～12 min 95%A，12～17 min 20%A，收集對應產物峰。產物作紫外光譜掃描，同時進樣SYNAPT G2-Si Q-TOF高分辨質譜儀作質譜鑒定，并于600 MHz核磁共振被譜儀上測定氫譜。

1.2.4 細胞毒性檢測 取指數生長期HepG2或RAW264.7細胞，調整細胞密度為1×105個·mL-1，以每孔200 μL的體積接種于96孔板，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養過夜。分別加入不同濃度的ESC和Bio-AHA-ESC，繼續培養22 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續培養2 h，于Enspire多功能酶標儀上檢測450 nm處吸光度（absorbance，A）值，每個濃度設3個復孔，同時設立試劑對照，計算細胞存活率。

1.2.5 氧化應激損傷保護作用檢測 取指數生長期HepG2細胞，以1×105個·mL-1的數量接種于96孔板，每孔200 μL，置于37℃，5% CO2培養箱中培養過夜。分別加入不同濃度的ESC和Bio-AHA-ESC，預培養2 h，然后加入終濃度為0.60 mmol·L-1的過氧化氫繼續培養22 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續培養2 h，酶標儀上檢測450 nm處A值，每個濃度設3個復孔，同時設立試劑對照，同上計算細胞存活率。

1.2.6 抗炎活性分析 取指數生長期RAW264.7細胞，接種于96孔板，貼壁培養過夜，加入不同濃度ESC和Bio-AHA-ESC預處理1 h后， 加入終濃度為200 μg·L-1的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激處理，12 h后吸取上清液50 μL，以流式CBA法測定炎癥因子水平。

1.3 統計學分析 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學分析和作圖。計量資料以±s表示，各組間比較采用一維方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同催化劑對產物合成的影響 稱取ESC 17.80 mg（0.10 mmol）、Bio-AHA 17.90 mg （0.05 mmol）、DCC 20.60 mg（0.10 mmol）或EDCI 19.20 mg（0.10 mmol）及DMAP 12.00 mg（0.10 mmol）。其中DCC催化反應先低溫反應3 h，然后恢復室溫反應至24 h；而EDCI直接室溫反應24 h，反應后分別取樣稀釋進行HPLC分析。見圖1。在上述羧基和羥基摩爾比為1:4的反應條件下，DCC催化約（49.18±5.93）%的ESC被轉化（圖1B中1號峰），而EDCI催化約（87.51±7.26）%的ESC被轉化（圖1C中1號峰）；生成的產物DCC催化產率僅為EDCI的（66.04±7.27）%（圖1B和C中2號峰），且DCC催化在31.35 min有一副產物（圖1B中3號峰），不利于產物分離純化。因此，從ESC轉化率、產物生成率和產物是否易于分離、純化的角度考慮，選擇EDCI作為催化劑較為合適。

圖1 反應24 h后樣品HPLC圖Fig.1 HPLC diagram of the samples after 24 h of reaction

2.2 反應溫度和時間對EDCI催化產物合成的影響以EDCI為催化劑，按照2.1中的各物質配比，一組冰浴攪拌反應3 h后恢復室溫反應，另一組直接室溫攪拌反應，分別于反應3、6、9和24 h精密吸取反應液20 μL，以色譜純乙腈稀釋到1 mL，0.22 μm濾膜濾過，進樣10 μL進行HPLC分析，通過比較2號峰面積變化，考察不同反應溫度和時間對產物產率影響。見圖2。從圖2A可以看出，反應3 h時室溫條件產物峰面積顯著高于冰浴條件峰面積（P＜0.05），說明室溫有利于產物生成；但6 h后無論冰浴還是室溫，各組峰面積差異無統計學意義（P＞0.05），因此確定室溫反應6 h為宜。

圖2 不同條件反應產物峰面積變化Fig.2 Changes of peak area of Bio-AHA-ESC under different reaction conditions

2.3 EDCI和DMAP催化劑用量對產物合成的影響按照2.1中的方法配比，固定其他試劑不變，分別考察不同EDCI添加量對產物產率影響。結果表明，當EDCI添加量與羧基等摩爾時（均為0.05 mmol），產物量顯著低于2倍羧基摩爾數（0.10 mmol）添加量（P＜0.01）；但繼續增加EDCI量，產物并無顯著增加（P＞0.05）。 見圖2B。因此，固定EDCI添加量為2倍羧基摩爾數（與ESC等摩爾數）?？疾霥MAP添加量對產物的影響，發現在0.01～0.15 mmol范圍內，DMAP添加量對產物產率無顯著影響（P＞0.05），即EDCI摩爾數十分之一的DMAP即可達到較好的催化效率。見圖2C。

2.4 Bio-AHA和ESC投料比對產物合成的影響 按照2.1中的方法，固定Bio-AHA為0.05 mmol，EDCI 0.10 mmol，DMAP 0.01 mmol，考察ESC與Bio-AHA摩爾比為0.5、1、2和3時對產物合成影響。結果表明，上述摩爾比為0.5～2范圍內，隨著ESC量增加，產物合成量顯著提高（P＜0.01）；但當摩爾比為2和3時，產物量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2D。因此確定兩者摩爾比以2為宜，此時羥基和羧基摩爾比為4。

2.5 Bio-AHA-ESC合成、純化和結構表征 按照2.1中的方法，稱取ESC 35.60 mg（0.20 mmol）、Bio-AHA 35.80 mg（0.10 mmol）、EDCI 38.40 mg（0.20 mmol）及DMAP 24.00 mg（0.20 mmol），以4 mL干燥DMF溶解，室溫攪拌反應6 h。直接進樣半制備液相色譜系統，收集9.48～9.85 min峰（見圖3A），經2次制備得到單一峰產物（見圖3B），減壓濃縮，冷凍干燥得產物32.56 mg。

圖3 Bio-AHA-ESC半制備液相色譜圖Fig.3 Semi-preparation liquid chromatogram of Bio-AHA-ESC

產物紫外光譜特征與ESC類似，但最大波長324.60 nm較ESC最大波長342.60 nm紫移18.00 nm。見圖4A、B。這與氨基己酸羰基吸電子效應導致ESC苯環電子云密度降低有關，表明已發生酯化反應。另外，產物二級質譜中呈現典型的Bio-AHA碎片離子（[M-H2O+H]+=340.17）、生物素碎片離子（[M-H2O+H]+=227.09）和氨基己酸碎片離子（[M-H2O+H]+=114.09）。見圖1C中d。表明Bio-AHA已與ESC酯化連接。而產物一級譜分子離子峰[M+H]+=518.20，表明ESC一個酚羥基被Bio-AHA衍生化。見圖1C中c。

為了進一步明確是6位還是7位酚羥基衍生化，對產物進行了核磁氫譜分析。比較ESC和Bio-AHA-ESC氫譜圖，可以發現產物H-5和H-8化學位移均向低場移動（見圖4C、D），這與羰基吸電子效應導致紫外光譜紫移結果一致；更為關鍵的是，H-5化學位移從原來的6.98變成7.39，顯著大于H-8氫化學位移變化（從6.74變成6.82），表明6位羥基被修飾，生成了圖4D中所示結構的衍生物，這一氫譜化學位移的改變與劉季紅等[19]報道的ESC衍生物氫譜化學位移變化規律一致。

圖4 ESC和Bio-AHA-ESC紫外光譜圖和核磁氫譜圖Fig.4 UV-VIS spectra and1H NMR spectra of ESC and Bio-AHA-ESC

2.6 Bio-AHA-ESC對過氧化氫誘導的HepG2細胞損傷保護作用 CCK-8結果表明， 在20～80 μmol·L-1范圍內，ESC和Bio-AHA-ESC對HepG2細胞無明顯細胞毒性。見圖5A。0.60 mmol·L-1過氧化氫顯著誘導HepG2細胞氧化損傷，而ESC和Bio-AHA-ESC均可劑量依賴性抑制過氧化氫誘導的HepG2細胞損傷。見圖5B。 在20～60 μmol·L-1范圍內，Bio-AHA-ESC保護作用稍優于ESC，且20 μmol·L-1時差異有統計學意義（P＜0.05）；但高劑量80 μmol·L-1時，兩者細胞存活率分別為（88.38±5.77）%和（84.13±6.50）%，ESC保護作用相對較強，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5B。

圖5 ESC和Bio-AHA-ESC對HepG2細胞生長的影響和對過氧化氫誘導的HepG2細胞損傷的保護作用Fig.5 Inhibitory effect of ESC and Bio-AHA-ESC on HepG2 cell growth and its protective effect on HepG2 cell injury induced by hydrogen peroxide

2.7 Bio-AHA-ESC的抗炎活性 在20～80 μmol·L-1范圍內，ESC和Bio-AHA-ESC對RAW264.7細胞無顯著細胞毒性。 見圖6A。 200 μg·L-1的LPS刺激24 h后，IL-6水平顯著升高（P＜0.01），而ESC和Bio-AHA-ESC均可劑量依賴性抑制IL-6分泌。總體上，相同濃度的藥物處理組間比較，ESC的抑制活性優于Bio-AHAESC，尤其60 μmol·L-1時兩者差異有統計學意義（P＜0.01）；80 μmol·L-1時兩者對IL-6抑制率分別為（82.49±2.06）%和（79.48±2.93）%，差異無統計學意義（P＞0.05）。 見圖6B。

圖6 ESC和Bio-AHA-ESC對RAW264.7細胞生長影響及其對LPS誘導的IL-6分泌抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of ESC and Bio-AHA-ESC on the growth of RAW264.7 cells and IL-6 secretion induced by LPS

3 討論

DCC和EDCI是常用的酯化偶聯催化劑，兩者均能在溫和條件下促進Bio-AHA羧基和ESC酚羥基發生酯化反應。但本研究發現，DCC催化在產物附近有一明顯的副產物，不利于產物分離純化，而且其催化ESC轉化效率和產物生成率低于EDCI，因此EDCI是較為理想的催化劑。但從投料比（ESC與Bio-AHA摩爾比為2:1，即酚羥基與羧基摩爾比為4:1）和最終生成的單酚羥基酯化產物看，如果Bio-AHA完全反應，理論上應有50%的ESC被轉化；但實際上EDCI催化后（87.51±7.26）%的ESC被轉化；說明部分ESC也被轉化生成了副產物，圖1C中2.5 min和3.0 min左右出現的峰證實了這一推測。

以EDCI為偶聯劑，本研究對反應溫度、反應時間、DMAP添加量、ESC和Bio-AHA投料比進行了優化，結果表明反應條件為ESC與Bio-AHA摩爾比為2:1，DMAP為EDCI摩爾數的十分之一，干燥DMF溶解室溫攪拌反應6 h時可獲得較高的產率。所得反應液直接通過半制備液相分離純化，即可獲得產物；經紫外光譜、核磁氫譜和高分辨率質譜鑒定為ESC 6位酚羥基Bio-AHA衍生化產物,即在上述反應條件下ESC 6位酚羥基活性較高，EDCI可選擇性催化其發生單酯化反應，這對今后類似鄰位酚羥基化合物衍生化研究具有一定指導意義。

近年來新型冠狀病毒肺炎的臨床治療研究表明，抗炎中藥具有重要開發應用價值[20]。ESC是中藥秦皮中主要功效成分之一，對哮喘具有較好療效；現代藥理學研究表明其具有較強抗炎活性[3]和氧化應激損傷保護作用[4]。因此，本研究對所制備的Bio-AHAESC的上述生物活性進行了初步評價，結果表明產物活性和ESC類似，對HepG2細胞和RAW264.7細胞毒性均較低，但均可劑量依賴性抑制過氧化氫誘導的HepG2細胞氧化應激損傷和LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥因子IL-6的釋放。而且在低劑量時（20.00 μmol·L-1），Bio-AHA-ESC氧化應激損傷保護作用優于ESC，80.00 μmol·L-1時兩者相當； 但抗炎方面，Bio-AHA-ESC抗炎活性較弱，尤其是濃度為60 μmol·L-1時弱于對應濃度的ESC，而且差異有統計學意義，但高濃度80.00 μmol·L-1兩者抗炎活性差異無統計學意義。

綜上所述，本研究建立了一種高效的Bio-AHAESC合成方法，工藝優化條件為：ESC與Bio-AHA摩爾比為2:1，DMAP添加量為EDCI摩爾數的十分之一，干燥DMF溶解室溫攪拌反應6 h?？寡住⒖寡趸钚栽u價結果表明，ESC經Bio-AHA衍生化后仍然保留了其生物學活性，這為后續采用ABPP揭示ESC可能的靶蛋白和確切分子機制奠定了良好基礎。