井岡山地區龍腦樟來源真菌多樣性和抗菌活性研究

劉文杰 張曉寒 吳佳歡 唐佳慧 姜淑玲 郭文強

(井岡山大學，吉安 343009)

來源于植物的微生物，如植物內生菌，由于棲息于植物組織，但對植物沒有危害，因此一直未受到重視，直到20世紀90年代，從中發現了紫杉醇和紫杉烷及喜樹堿等具有重要藥用價值的天然產物，這些植物來源的微生物才引起了廣泛的關注[1]。基于植物來源真菌次級代謝產物的大量研究發現，其在抗病毒、抗炎、抗菌和抗腫瘤等方面表現出巨大的開發潛力，已經成為特殊生態環境來源新藥研發的熱點[2-5]。井岡山國家自然保護區地處我國江西省腹地，是一個極具南方紅壤丘陵特色、又兼顧森林地貌的生態環境，微生物群落豐富多樣[6]。植物龍腦樟作為井岡山地區重要的藥用樟品種，其枝葉精油中富含右旋龍腦，是提取天然冰片的主要來源。目前，國內外對龍腦樟關注的焦點集中在包括冰片在內的揮發性精油方面，鮮有其內生菌方面的研究[7]。文獻報道，龍腦樟內部微環境富含小分子精油，作為微生物的一種特殊的生存壓力，預示著與該植物相關的真菌可能具有獨特的代謝途徑。對樟樹來源真菌次級代謝產物開展的抗菌研究發現，其對導致花卉植物根部壞死的病原菌隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)具有較強的生物活性[8]。植物微環境的特殊性，使得與其相關的微生物具有產生潛在藥用價值化合物的可能性。

本研究選擇物種資源豐富的井岡山地區，聚焦內部微環境特殊的龍腦樟組織及樹周苔蘚，開展了可培養真菌的分離工作，并對其發酵產物進行抗菌活性檢測，以期獲得具有抗菌活性真菌菌株，為新活性化合物發現和全面了解井岡山地區藥用真菌資源奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品

新鮮健康的龍腦樟樹皮、樹葉、種子及樹周苔蘚樣品于2019年10月采集于江西省吉安市羅霄山脈中段。每個采樣區域采集的2～4份樣品，并按樣品類別分別合并為大樣品，用于可培養真菌的分離純化，樣品信息見表1。樣品采集后裝入無菌自封袋中，運抵實驗室后置于4℃冰箱中保藏。

表1 羅霄山脈中段采集的樣品信息Tab.1 Information of samples collected from middle part of Luoxiao Mountains

1.1.2 實驗儀器

循環水式真空泵(型號：SHK-Ⅲ，鄭州科泰實驗設備有限公司)；旋轉蒸發儀(型號：RE-2000A，鄭州科泰實驗設備有限公司)；恒溫培養箱(型號：DNP-9082P03Ⅳ，上海新苗醫療器械制造有限公司)；超凈工作臺(型號：SW-CJ-2D，蘇州蘇潔凈化設備有限公司)；高壓滅菌器(型號：KXQ-LS，上海博訊有限公司)；低溫冷卻液循環泵(型號：DLSK-5/20，鄭州科泰實驗設備有限公司)；電子天平[型號：BSA-124SNMR，賽多利斯(上海)貿易有限公司]，高效液相色譜儀[型號：1515，沃特世科技(上海)有限公司]。

1.1.3 指示菌

草分枝桿菌BNCC359483、枯草芽胞桿菌BNCC109047、恥垢分枝桿菌BNCC134980、金黃色葡萄球菌BNCC186335、大腸埃希菌BNCC336902采購自北納創聯生物科技有限公司。

1.1.4 真菌培養基

固體分離培養基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，g/L)：馬鈴薯200.0，葡萄糖20.0，瓊脂18.0。液體發酵培養基(真菌2號，g/L)：葡萄糖10.0，麥芽糖20.0，谷氨酸鈉10.0，甘露糖醇20.0，KH2PO40.5，玉米漿1.0，酵母浸粉3.0，MgSO4·7H2O 0.3，pH6.5。每種培養基添加抑制劑的種類、濃度參照文獻方法[9]。

1.2 方法

1.2.1 真菌分離與純化

用自來水將采集的龍腦樟各部位及樹周苔蘚樣品沖洗干凈，置于超凈臺晾干，用75%酒精浸泡處理1 min后，無菌水沖洗3次，5%次氯酸鈉溶液浸泡5 min后，再用無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干樣品表面水分。組織樣品無菌操作，切成約0.5 cm2的組織塊,置于PDA固體培養基表面；樹周苔蘚樣品進行無菌研磨處理，研磨后的液體均勻涂抹在培養基表面，室溫培養3～5 d[9-10]。從培養基表面挑取單菌落，針刺法接種至PDA固體平皿，并在室溫下繼續培養36 h后分離純化得到不同形態的真菌菌落。通過對比菌落形態、顏色、質地和孢子形態以及色素等培養特征，進行初步地去重復，最終得到純菌株。

1.2.2 真菌初步鑒定

采用生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成的ITS 通用引物：ITS1 (5'-AGAA GTCGTAACAAGGTTTC-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3')[11-12]。PCR擴增產物1%的瓊脂糖膠電泳檢測合格后，送至北京睿博生物科技有限公司測序。通過BLAST分析將鑒定出的序列與GenBank數據庫中的數據進行分析，并在ClustalW軟件進行進一步比對[13]。利用Godinho提出的標準來分析驗證GenBank數據庫的BLAST結果：覆蓋率和序列同一性≥98%為同一個種；覆蓋率和序列同一性在95%～97%之間，可以確定為同一屬，而覆蓋率和序列同一性≤95%，則可以認為是新菌[14]。

1.2.3 真菌發酵培養與抗菌活性測試

將獲得的真菌分別接種至真菌2號液體發酵培養基中，室溫靜置發酵培養30 d。采用與文獻[9]相同的菌株發酵條件及提取方法獲得發酵產物提取物。以5種指示菌進行粗提物抗菌活性篩選與評價，陽性對照為氯霉素。采用瓊脂紙片擴散法開展抑菌活性測試，紙片直徑為10.0 mm，制備含提取物的紙片的方法參照文獻[9]，將藥敏紙片放置在指示菌瓊脂表面上，于37℃培養箱中培養24 h。通過測量抑菌圈直徑來評價其抗菌活性強弱。抗菌活性評價標準：抑菌圈直徑＜11.0 mm代表活性較弱；抑菌圈直徑11.0～15.0 mm代表中等活性；抑菌圈直徑＞15.0 mm代表活性較強。

1.2.4 次級代謝產物指紋圖譜分析與分離純化

真菌粗提物代謝物指紋圖譜分析采用高效液相(HPLC，美國Waters公司)，分析條件：5%～100%甲醇線性梯度洗脫45 min[9]。菌株JDWHS-7-081靜置發酵30 d，過濾后，菌體甲醇浸泡，超聲破碎；發酵液乙酸乙酯萃取兩次，減壓蒸餾。兩部分合并，獲得粗浸膏12.5 g。粗浸膏以硅膠柱層析進行分離，石油醚/丙酮系統(20:1～1:1)洗脫，所得7個組分進行抗菌活性測定。其中組分4表現出較好的抗菌活性，進一步采用甲醇為流動相的葡萄糖凝膠LH-20的色譜柱對組分4進行純化，收集8個組分，對獲得組分3采用ODS-C18半制備柱(YMC-Pack ODS-A,10 mm × 250 mm,5 μm,3 mL/min)，流動相比例：甲醇:水=65:35進行制備，獲得保留時間為28.6 min的化合物1純品。

1.2.5 數據分析與處理

為評價龍腦樟來源優勢真菌組成情況，分別統計分析真菌的分離率(isolation rate,IR)、定殖率(colonization rate,CR)、相對頻率(relative frequency，RF)[10]。分離率(IR)是指從樣本組織塊中得到的菌株數與全部樣本組織塊數的比值，IR=(組織塊中得到的菌株數/實驗供試的總組織塊數)×100%。定殖率(CR)指樣本中受真菌侵染的組織塊數占全部樣本組織塊數的百分數，CR=(有真菌侵染的組織塊數/實驗供試的總組織塊數)×100%。相對頻率(RF)是指樣本中分離到的某種真菌的菌株數占分離到總菌株數的百分數，RF=(樣本中分到的某種真菌的菌株數/分到的總菌株數)×100%。

2 實驗結果與討論

2.1 龍腦樟來源真菌初步鑒定與分析

通過組織分離法從龍腦樟的各個樣品中獲得真菌197株，對其歸類分析發現涵蓋子囊菌類和接合菌類兩大真菌類群。基因序列對比結果顯示大部分菌株與數據庫最接近的種屬具有較高的相似度，初步推斷該來源真菌隸屬于10個目20個科29個屬(表2)。

表2 197株真菌的物種分布Tab.2 The genera distribution of 197 fungi

2.2 不同部位的真菌的分離率和定殖率

從龍腦樟的葉片、樹皮、種子及樹周苔蘚樣品中分別分離到真菌38、44、31和84株。真菌的分離率和定殖率在不同樣品中存在較大的差異，分離率依次為樹周苔蘚(71.8%)＞樹皮(63.2%)＞葉片(58.8%)＞種子(45.5%)；定殖率依次為樹周苔蘚(69.5%)＞樹皮(60.4%)＞葉片(55.7%)＞種子(40.6%)。結果顯示不同分離部位真菌的分離率和定殖率趨勢一致，但具有一定的差異性，其中樹周苔蘚的分離率和定殖率都最高，種子的分離率和定殖率最低(圖1)。

2.3 不同部位真菌組成及不同菌種的相對頻率

龍腦樟中優勢菌屬為青霉屬和曲霉屬，它們相對頻率分別為28.93%和15.22%。盡管總體而言，青霉屬和曲霉屬為優勢菌屬，但龍腦樟各部位之間優勢屬真菌并不完全相同。從樹葉樣品分離到的38株真菌，分布于9個屬，以青霉屬(12株)為優勢菌屬，占總數的31.57%；從樹皮樣品分離到的44株真菌，分布于11個屬，以曲霉屬(13株)為優勢類群，占總數的29.54%；從種子樣品分離到的31株真菌，隸屬于7個屬,以青霉屬(10株)為優勢類群，占總數的32.25%；從樹周苔蘚樣品分離到的84株真菌，隸屬于19個屬，以青霉屬為優勢菌(24株)，占總數的28.57%。以上可見，不同部位的真菌群落組成各不相同，真菌群落的多樣性和分布因分離部位而異。

2.4 真菌次級代謝產物抗菌活性

所有分離到的真菌菌株，室溫靜置發酵30 d，獲得197個代謝粗提物，抗菌活性篩選結果發現，82株真菌的代謝產物至少對1種指示菌表現出抑制活性，總陽性率為41.62%，其中50株真菌顯示出廣譜的生物抑制活性(表3)。其中菌株JDWHS-7-081、JDWHS-7-086、JDWHS-9-27和JDWHS-10-02的次級代謝產物對多種指示菌顯示出較好的抑制活性，這為后續實驗奠定了基礎。

表3 龍腦樟來源真菌次級代謝產物抗菌活性Tab.3 Antibacterial activity of secondary metabolites of fungi from Cinnamomum camphora Chvar.Borneol

續表3

2.5 菌株JDWHS-7-081的次級代謝產物研究

對菌株JDWHS-7-081的代謝產物進行抗菌活性追蹤研究，從中獲得了1個代謝主產物化合物1，其NMR數據與文獻報道的已知化合物一致[15]，可以確定化合物1為混源萜類化合物Austin(圖2)。

化合物1白色粉末；ESI-MS:m/z501 [M+H]+(C27H32O9)。1H NMR (500 MHz,DMSO-d6)δH: 6.88(1H,s),6.72 (1H,d,J= 9.5 Hz),6.07 (1H,s,J= 10.0 Hz),5.80 (1H,s),5.75,5.26 (2H,s),4.82 (1H,q,J= 6.0 Hz),3.31 (2H,m),3.28 (2H,m),2.00 (3H,s),1.69 (3H,s),1.54(3H,s),1.46 (3H,s),1.29 (3H,s),1.15 (3H,d,J= 6.0 Hz),1.11 (3H,s)。13C NMR (125 MHz,DMSO-d6)δC: 171.8,169.2,169.2,163.6,148.2,142.0,137.7,133.5,119.6,118.1,85.7,83.4,81.1,79.3,74.9,63.4,46.7,42.4,26.8,26.7,26.2,23.9,22.6,21.0,20.4,15.3,12.3。

3 討論

3.1 可培養真菌的多樣性

樟樹在我國南部各省份廣泛分布，是南方重要的藥用和綠化樹種。對該屬植物化學成分研究發現，其中多含揮發油、生物堿、瑞諾烷類二萜、芳香化合物、多酚、黃酮和有機酸等，現代藥理研究也發現其具有多種生物活性[16-17]。龍腦樟作為井岡山地區樟樹的一個重要樹種，內部環境復雜且具有特點，棲息其中的真菌可能因生存壓力而進化出獨特的生物合成代謝途徑，針對其研究可能獲得結構類型新穎的活性天然產物。本研究以井岡山地區龍腦樟的各個部位樣本作為研究對象，獲得了197株歸屬于10個目20個科29個屬的可培養真菌，顯示出較好的物種多樣性。同時，在我們的研究中還發現真菌群落的多樣性和豐度在不同樣品之間存在差異，不同部位間的真菌類屬也具有明顯的差異。總體來說，江西龍腦樟不同部位的微環境差異可能會影響其中微生物分布特征。

3.2 可培養真菌的生物活性

近幾十年來，植物來源真菌作為特殊生境來源的微生物受到越來越多的關注，已成為生物活性物質重要的資源庫[18]。研究發現，植物真菌已經進化出適應植物微環境的遺傳和代謝機制，這意味著該來源的真菌具有產生結構類型獨特的代謝產物的潛力[19]。本研究以瓊脂紙片法研究了197株龍腦樟可培養真菌在實驗室條件下次級代謝產物的抗菌生物活性，發現50株具有廣譜抗菌活性的菌株，其中JDWHS-7-081和JDWHS-10-27表現出較為突出的抑菌活性。這些未開發的活性菌株有待進一步開展天然產物研究。

通過對活性菌株JDWHS-7-081代謝產物研究獲得了混源萜類類化合物1，該類化合物通常從真菌，尤其是曲霉屬和青霉屬[20-21]真菌培養產物中獲得。混源萜類化合物是類異戊二烯來源的天然產物，其中混合聚酮-萜類是一類重要結構類型，并且起始于3,5-二甲基芥子酸(DMOA)的混源萜類化合物是最常見的亞類[22]。迄今為止，已經發現了100多種DMOA衍生的混源萜類化合物，其在抗菌、抗蟲和酶抑制活性領域表現出巨大的研究潛力[23-24]。

綜上所述，井岡山地區龍腦樟來源可培養真菌的物種多樣性較為豐富，獲得的抗菌活性菌株為后續深入開展天然產物研發研究奠定了菌株基礎。