TCAB1蛋白在喉鱗癌組織中的表達及與臨床特征之間的關系

魯 丹 張 燚 胡 安 李 璨 喬培培 薛曉成 陳曉平

上海市浦東新區公利醫院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200135

喉鱗癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤之一[1]，喉鱗癌患者早期癥狀常不明顯，發現時多數處于中晚期，術后生活質量不佳[2]。頭頸部鱗癌的發生受到多種因素的影響，有研究表明EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染與頭頸部鱗癌的發生密切相關[3]。

EBV是普遍存在的人類γ-皰疹科病毒，在腫瘤細胞中能有效地激活細胞周期，使被感染的細胞能夠持續增殖，EBV可以表達具有轉化特性的各種潛伏期相關蛋白[4]，這些蛋白的過表達促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，阻斷病毒裂解復制，確保胞外病毒基因組準確地向子代細胞分化。同時可以通過多種不同的信號通路上調腫瘤細胞系中端粒酶的活性[5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011—2018年寧夏醫科大學附屬總院（n=113）和上海市眼耳鼻喉科醫院的耳鼻咽喉科（n=12）收治的125份喉鱗癌組織及癌旁組織標本。標本患者中男122例，女3例，年齡37～82歲。根據世界衛生組織對年齡段的劃分[6]，分為青年組、中年組、年輕老年組、老年組。根據病程長短劃分為三組，＜1年組，1～2年組，＞2年組。根據美國癌癥協會（American joint committee on cancer，AJCC）2017年第8版的喉鱗癌臨床分期標準將喉鱗癌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期[7]。根據病理分化程度劃分為低分化組、中分化組、高分化組。根據腫瘤的發生部位，可以劃分為聲門上區、聲門區、聲門下區、跨聲門區。本研究經上海市浦東新區公利醫院倫理委員會通過。

1.2 納入及排除標準

納入標準：經手術及病理證實為喉鱗癌；有完整的臨床資料（包括術前影像學檢查、術后隨訪）；每例喉鱗癌標本均能正常進行EBV檢測及免疫組化染色、Western blotting技術檢測。排除標準：術前有化療或放療史；復發的患者；合并鄰近組織的腫瘤；合并其他臟器的腫瘤；收集的喉鱗癌標本無完整癌旁組織對照組。

1.3 方法

將125份喉鱗癌及癌旁組織石蠟樣本進行EBV基因檢測，同時進行TCAB1蛋白免疫組化檢查。結果判斷：根據細胞陽性著色程度，著色成功的視為陽性，未成功著色的視為陰性。根據細胞陽性著色數量及占比可分為陰性（-）、弱陽性（+-）、陽性（+）、中等陽性（++）及強陽性（+++）。陽性率=（弱陽性+陽性+中等陽性+強陽性）例數/總例數×100%。

1.4 統計學方法

應用SPSS 22.0統計學軟件對研究數據進行統計學分析。計數資料采用χ2檢驗，生存函數Kaplan-Meier法進行生存率的分析，使用Log-rank檢驗比較生存風險，終點事件為患者病死，生存時間以月為單位進行統計。采用生存分析及COX回歸模型統計學方法，對有效數據進行生存狀況分析。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EBV在喉鱗癌組織中的表達情況

本研究發現分化程度、臨床分期、腫瘤部位與EBV感染比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05），可認為患者的分化程度、臨床分期、腫瘤部位與EBV感染無相關性。見表1。

表1 喉鱗癌組織中EBV感染與患者臨床病理特征的關系[n（%）]

2.2 TCAB1蛋白在喉鱗癌組織中的表達情況

2.2.1 TCAB1蛋白在喉鱗癌組織中的表達情況 125例喉鱗癌組織標本中TCAB1蛋白表達陽性98例，陽性率為78.4%。TCAB1基因是位于細胞核內染色體末端的端粒酶上（圖1A～D），TCAB1蛋白主要在細胞核內表達，細胞質中也有少量表達（圖1E～F），差異有統計學意義（P＜ 0.05），提示TCAB1蛋白較正常組織在喉鱗癌組織中更高表達。見表2。

表2 TCAB1蛋白在喉鱗癌組織及其癌旁組織中的表達

圖1 喉鱗癌組織中TCAB1的不同分級表達

2.2.2 喉鱗癌組織中TCAB1蛋白表達與患者臨床病理特征的相關性情況 TCAB1蛋白陽性組腫瘤部位與TCAB1蛋白陰性組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05），認為喉鱗癌組織中TCAB1蛋白表達與患者的腫瘤部位、臨床分期、病理分化程度無相關性。見表3。

表3 TCAB1蛋白表達與喉鱗癌患者臨床病理特征的關系

2.2.3 喉鱗癌組織中TCAB1蛋白的表達與EBV感染的相關性情況 喉鱗癌組織中TCAB1蛋白過表達與EBV感染有相關性，見表4，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

表4 喉鱗癌組織中TCAB1蛋白表達與EBV感染的關系

2.3 喉鱗癌術后患者生存分析

2019年3 月通過電話隨訪寧夏醫科大學總院收集的113份喉鱗癌患者術后生存狀態，失訪38例，有效數據75例，男73例，女2例。復發/轉移2例，病死7例。

2.3.1 喉鱗癌患者的一般臨床特征與預后關系的分析 本研究中喉鱗癌患者總生存率為86.7%，1年總生存率為98.7%，3年總生存率為96.0%，5年總生存率為90.7%，8年總生存率為86.6%。累積生存函數圖顯示隨著隨訪時間逐步遞增，喉鱗癌術后患者的生存率逐步下降，累積風險函數圖顯示隨著隨訪時間逐步遞增，喉鱗癌術后患者的病死風險逐步攀升（圖2）。可以認為腫瘤部位是喉鱗癌患者術后的預后獨立危險因素（P＜ 0.05）。見表5。

表5 腫瘤部位的COX比例風險分析

圖2 累計生存函數

2.3.2 TCAB1表達與生存狀況分析 75例隨訪數據中，TCAB1陽性喉鱗癌患者有60例，其中病死9例，陰性喉鱗癌患者15例，其中病死2例。TCAB1陽性喉鱗癌患者中1年生存率為98.3%，3年生存率為91.5%，5年生存率為89.2%，8年生存率為53.0%。TCAB1陰性喉鱗癌患者中1年生存率為100%，3年生存率為92.9%，5年生存率為82.5%。經統計分析可以認為TCAB1蛋白的表達情況與喉鱗癌術后患者的預后差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖3。

圖3 TCAB1蛋白表達情況與喉鱗癌術后患者預后的生存曲線

3 討論

惡性腫瘤較正常組織最大的不同之處在于其侵襲力強、容易復發轉移和增殖能力無限，容易使人發生惡病質。端粒是位于染色體末端控制細胞增殖的基因位點，在分化良好的組織中其活性受到抑制，而在惡性腫瘤中被重新激活。TCAB1蛋白作為端粒酶全酶的一種，在端粒酶活性的維持和激活中起著關鍵作用[8]。本研究采用免疫組化和Western blotting檢測從蛋白質水平分析了TCAB1基因的表達異常是否參與了喉鱗癌的發生發展，并探討了TCAB1蛋白的表達與EBV感染是否相關。結果表明喉鱗癌組織中TCAB1蛋白的表達與EBV感染有關。本研究還利用生存分析統計學方法分析了喉鱗癌術后患者預后的獨立危險因素，發現EBV感染與TCAB1蛋白的表達與喉鱗癌患者預后無明顯相關性。

本研究發現喉鱗癌患者絕大多數為男性（122/125，97.6%），女性中較少見。年齡多在中年人到年輕老年人階段（45～74歲，86.4%），腫瘤發生部位多位于聲門區（92/125，73.6%），病程多在一年之內（91/125，72.8%），然而臨床分期之間和病理分化程度之間并無顯著差別。這與我國多次統計的結果一致[9]。男性患者更易罹患喉鱗癌，具體原因仍不明確。有研究認為喉鱗癌的發生與持續飲酒、高齡以及男性喉部作為男性發育的第二性征、積累的雄性激素較女性明顯增多等因素有關[10]。喉鱗癌多位于聲門區，早期即可表現聲音嘶啞、刺激性咳嗽，患者多以此為首發癥狀就診，故一年內發病者較多見。位于聲門上區及聲門下區喉鱗癌患者由于早期癥狀多不明顯，就診發現時多為中晚期，術后生活質量較差[11]。

關于EBV感染與喉鱗癌的相關性研究，國內外尚無統一意見。本研究結果與前期研究有一定的異同，研究較一致的是EBV感染與喉鱗癌患者的喉鱗癌組織的分化程度、臨床分期、腫瘤部位無顯著相關性[12]。Muderris等[13-14]的研究中EBV感染陽性率較本研究明顯減少，分析其原因可能與Muderris 等研究中樣本量少有關，而Vazquez-Guillen等[14]研究采用的檢測方法是水解PCR探針，與本研究方法有出入，且可能與研究人群的民族和地域不同有關。

TCAB1又稱WDR79，WRAP53，是真核細胞染色體末端的重復WD結構，維持卡哈爾體形成、端粒的延長及DNA損傷修復，在將端粒運輸到卡哈爾體的過程中具有重要作用[15]。但與頭頸腫瘤的相關性及具體機制研究較少，Sun等[16]發現TCAB1在頭頸惡性腫瘤的臨床標本和癌細胞系中顯著過表達，隨著TCAB1的下調，體外細胞的增殖潛能和侵襲能力也出現了明顯降低，異種移植實驗也證實，TCAB1基因的沉默會抑制裸鼠腫瘤的形成。Mahmoudi等[17]發現TCAB1的過表達與頭頸腫瘤的預后不良相關，TCAB1蛋白的下調可以通過線粒體途徑引起大量細胞凋亡，Bax/Bak的活化、線粒體膜電位的喪失和細胞色素C的釋放，與正常細胞相比腫瘤細胞對TCAB1的耗竭更為敏感。在喉鱗癌放射治療方面，Qiu等[18]發現可利用RNA干擾技術降低TCAB1的表達影響端粒長度來提高喉鱗癌細胞系的放射敏感性。本研究采用免疫組化法分析了125份喉鱗癌患者的腫瘤標本，發現TCAB1蛋白在喉鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。喉鱗癌的發生發展及其預后與喉鱗癌發生的部位、臨床分期、病理分化程度都有一定的關系。Tang等[19]回顧性分析了659例喉鱗癌患者的術后生存情況，指出臨床T分期、喉鱗癌組織分化程度是喉鱗癌復發和進展的獨立危險因素。而本研究發現TCAB1蛋白的表達與喉鱗癌患者的組織分化程度、臨床分期、腫瘤部位無明顯相關性。因此，TCAB1基因影響喉鱗癌發生的具體作用機制仍需要繼續探討，進一步研究TCAB1在喉鱗癌發生發展以及預后等過程中的作用機制。

本研究采用生存分析方法對隨訪到的75例患者數據進行分析，發現喉鱗癌術后患者的預后與其臨床分期、病理分化程度無明顯相關性，同時EBV感染、TCAB1蛋白表達情況與喉鱗癌預后也無明顯關系。這與其他研究者結果有差異。可能的原因主要有：①本研究對象為2011—2018年喉鱗癌術后患者，失訪患者嚴重影響了研究結果；②本研究對象為寧夏地區喉鱗癌患者，可能存在地域差異。