基于網絡藥理學研究黃精丸防治阿爾茨海默病的作用機制

李 莉 李 鈺 楊紹杰

1.電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院·成都市婦女兒童中心醫院藥學部，四川成都 611731；2.西南醫科大學，四川瀘州 646000；3.成都市慢性病醫院神經內科，四川成都 610017

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是1906年首次由德國精神病學家和神經病學家Alzheimer Alois發現，并以其名字命名的一種慢性神經退行性疾病，是老年期癡呆最常見的一種類型，也是導致老年人失能的重要原因之一[1]。據Alzheimer’s Association報道，預計到2050年AD患者將接近1.14億，每33秒就會新增一位AD患者[2]。目前AD可能的發病機制有β淀粉樣蛋白毒性學說、tau蛋白過度磷酸化學說、膽堿能學說、氧化應激學說等[3]。然而沒有任何一種假說能全面解釋AD所有的病理特點，目前主要認為是多種因素共同作用的結果。而目前對于AD的藥物研究方面，臨床上主要使用西藥治療，如膽堿酯酶抑制劑、興奮性氨基酸受體拮抗劑、腦蛋白水解物及其他緩解AD癥狀的藥物[4]。這些藥物雖然可使患者癡呆癥狀相對減輕，但引發的不良事件也較多。

近年來，應用中藥提取物及其衍生藥物治療AD的研究日益增多。與西藥相比，我國特有的中藥具有治療效果較好、毒副作用較低等優點。據楊晶瑩等[5]的研究，古方黃精丸具有潛在防治AD作用。從黃精丸防治AD相關的試驗與臨床研究結果來分析，黃精丸與地黃飲子[6]、開心散[7]等中藥復方相似，具有多層次、多靶點、多方向防治AD的特點，而有關黃精丸防治AD的相關研究還處在空白階段，有關該復方的相關試驗及臨床研究報道極少，現有的相關研究尚未完全闡明其作用機制，并且由于中藥成分的多樣性和作用機制的多靶點、多通路，傳統的研究方法很難實施。而近年興起的網絡藥理學是基于網絡觀點，從系統水平分析藥物作用機制、發現先導化合物或新適應證、識別新藥靶點的一種新的研究角度，其與中醫藥整體調控機體的理念相吻合，同時也能大大降低后續試驗研究的工作量[8]。因此本研究將網絡藥理學思路應用于黃精丸防治AD的作用機制探討，旨在為后續的試驗研究方向提供一定的信息支撐，并將經典中藥古方發揚光大。

1 材料與方法

1.1 分析軟件及數據庫

主要包括中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、DrugBank數 據 庫、UniProt數 據 庫、GeneCards數 據 庫、OMIM數據庫、String數據庫、Venny 2.1、R 4.0.3、Cytoscape 3.8.1等軟件。

1.2 黃精丸活性成分篩選及作用靶點預測

通 過TCMSP數 據 庫[9]（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）按照如下名稱：黃精（Polygonati Rhizoma）和當歸（Angelicae Sinensis Radix）檢索黃精丸2味中藥的化學成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%的，類藥性（drug-like index，DL）≥0.18的原則篩選[10]。利用DrugBank數 據 庫（https://www.drugbank.ca/releases/latest）和Uniprot數據庫（http://www.uniprot.org/）預測篩選、收集活性成分的潛在靶點，標準化蛋白名稱，得到黃精丸活性成分的潛在作用靶點。

1.3 疾病靶點及藥物與疾病靶點交集預測

以“Alzheimer’s disease”為 關 鍵 詞，檢 索GeneCards數 據 庫（https://www.GeneCardssorg/）、OMIM數據庫（https://omim.org/），得到AD相關的疾病基因。刪除疾病靶點中多余重復的靶點，得到AD相關靶點。用韋恩圖（Venny 2.1）繪制活性成分靶點和AD靶點的交集。

1.4 蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將藥物疾病共有靶點輸入String數據庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）構建PPI網絡，生物種類設定為“Homo sapiens”。以節點連接度值（degree）為指標，篩選核心蛋白質靶標，以R 4.0.3軟件繪制度值排名前20的靶點柱狀圖。

1.5 構建成分-靶蛋白-信號通路網絡

以篩選所得的黃精丸有效成分、AD靶點及靶點所屬信號通路為基礎，通過Cytoscape構建成分-靶蛋白-信號通路網絡，運用Tools面板中的Network analysis計算網絡參數。

1.6 GO（Gene ontology）富集分析

將黃精丸防治AD的靶點信息導入Metascape平臺，選擇物種信息為“Homo Sapiens”，進行GO注釋分析，設置閾值P＜ 0.01，篩選出排名靠前的20個GO注釋結果。

1.7 KEGG（Kyoto encyclopedia of gene and genomes）通路富集

將黃精丸藥物和AD交集靶點進行KEGG通路富集分析，設置P＜ 0.05，利用String數據庫，使用R 4.0.3軟件，繪制氣泡圖。

2 結果

2.1 黃精丸有效成分及其靶點

通過TCMSP數據庫檢索黃精丸中黃精和當歸的化學成分，獲得黃精有效成分38個、當歸有效成分95個，按照OB值和DL值篩選活性成分，選出黃精11個、當歸2個，去重后獲得黃精丸的活性成分12個，見表1，最終得到黃精丸活性成分潛在作用靶點蛋白265個。

表1 黃精丸活性成分信息表

2.2 疾病靶點篩選

以“Alzheimer’s disease”為關鍵詞在GeneCards數據庫和OMIM數據庫中篩選，去重后得到AD靶點基因1000個。

2.3 藥物與疾病靶點交集

用韋恩圖（Venny 2.1）繪制黃精丸活性成分靶點和AD靶點的交集，共92個，見圖1。

圖1 AD與黃精丸活性成分靶點韋恩圖

2.4 PPI網絡構建分析

PPI網絡中共92個節點、787條邊，平均度值為17.1，見圖2。根據其度值篩選出排名前20位的核心靶點，包括AKT1、TP53、VEGFA、SIRT1、EGFR等，見圖3。

圖2 黃精丸與AD共同靶點PPI網絡圖

圖3 黃精丸治療AD的前20位核心靶點

2.5 藥物-成分-靶點網絡拓撲圖

利用Cytoscape軟件構建黃精丸藥物-成分-靶點網絡拓撲圖（圖4）。該網絡圖中包含130個節點、1252條邊。在黃精丸防治AD作用網絡圖中，根據中心度，排名靠前的成分是 黃 芩 素（baicalein）、5，4’-二 羥 基 黃 酮（4’，5-Dihydroxyflavone）、甘 草 素（DFV）、3’-甲氧 基 大 豆 苷 元（3’-Methoxydaidzein）、β-谷甾醇（beta-sitosterol），度值排名靠前的靶點有PIK3CA、PIK3CB、EGFR、NOS2、MAPK3等。

圖4 藥物-成分-靶點網絡拓撲圖

2.6 GO富集分析

GO注釋分析通過共同的語義來描述基因生物學功能，GO注釋結果見圖5A～C。

圖5 黃精丸治療AD的潛在靶點GO富集分析

2.7 KEGG通路富集

總共富集到146條信號通路，選擇排名前20的通路并以氣泡圖展示，見圖6。排名靠前的主要有癌癥信號通路、代謝通路、PI3K-Akt信號通路、神經退行性性變信號通路、AD等。

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

3 討論

AD病灶在腦，在中醫學中屬于“健忘”“呆病”等范疇，與腎虛血瘀有關[11]。《傷寒論》提到“陽明病，其人喜忘者，必有蓄血”，《類證治裁》提到“若血瘀于內，則善忘如狂”[12]。AD屬本虛標實之證，本虛為腎精虧虛、氣血不足致腦髓失養，標實為血瘀絡滯、痰濁互結則腦脈痹阻[13]。

黃精丸中黃精可補腎填精、益氣養陰、健脾潤肺[14]，當歸活血通絡、補血和血、氣暢血行[15]，全方共奏補腎填精、活血通絡之功。綜上所述，黃精丸用于AD防治具有扎實的中醫理論依據。黃精提取物可改善AD大鼠的學習記憶，降低海馬tau蛋白磷酸化[16-17]。未小明等[18]也證實黃精對AD大鼠的行為認知、學習記憶能力等有明顯改善作用。另有研究顯示，黃精的主要成分黃精多糖可顯著保護AD大鼠的海馬神經元，并可減少細胞丟失，抗神經細胞凋亡[19]。當歸性溫，味甘、辛，歸肝、心、脾經[20]。當歸具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗AD及神經保護功能[21]。吳紅彥團隊發現當歸提取物及有效組分（當歸多糖、當歸揮發油及阿魏酸）可提高腦組織膽堿能神經遞質、抗自由基活性，從而改善AD大鼠、小鼠的學習記憶能力[22-23]。研究發現，當歸水提取物可下調糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）酶活性，進而降低tau蛋白磷酸化水平[24]。此外，當歸的有效成分藁本內酯[25-26]、阿魏酸對雙側頸總動脈閉塞導致的血管性癡呆（vascular dementia，VD）大鼠也具有良好的保護作用，均可顯著改善VD大鼠的學習記憶，增強其認知能力[27]。但黃精丸防治AD的物質基礎和作用機制尚未明確，有待深入研究。

本研究發現黃精丸7個活性成分參與AD的治療，其中度值排名靠前的成分是黃芩素、5，4’-二羥基黃酮、甘草素、3’-甲氧基大豆苷元、β-谷甾醇）。研究發現，黃芩素能夠抑制Aβ25-35損傷的PC12細胞的氧化應激，降低毒性反應，顯示黃芩素具有改善認知功能和學習記憶的能力[28]。杜燁湘等[29]的研究顯示，甘草素可有效抑制AD模型細胞的炎癥反應，其機制可能與其能上調ERβ蛋白的表達有關。黃芩素、5，4’-二羥基黃酮、甘草素、3’-甲氧基大豆苷元均屬于黃酮類成分。黃酮類成分是在自然界大量存在的一類具有廣泛活性的中藥化合物，可通過抑制膽堿酯酶活性、抑制氧化應激及清除自由基、修飾tau蛋白、減少Aβ形成、抑制炎癥因子表達而有效阻斷AD的疾病進展[30]。而β-谷甾醇也是黃芩的有效成分，具有抗氧化作用，并通過抑制體內補體系統的激活而發揮抗炎作用[31]。上述成分可能是黃精丸治療AD的主要藥效物質基礎。

PPI蛋白相互作用分析結果顯示，黃精丸治療AD的核心靶點主要有AKT1、TP53、VEGFA、SIRT1、EGFR等；藥物-成分-靶點網絡拓撲圖中PIK3CA、PIK3CB、EGFR、NOS2、MAPK3的度值相對較大。AKT1是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要調控細胞的增殖和生長，參與細胞凋亡和葡萄糖代謝。TP53編碼的蛋白質響應多種細胞應激，調節靶基因的表達，從而誘導細胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA修復或代謝改變。VEGFA是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，可促進血管內皮細胞遷移、血管新生，增加血管通透性及維護內皮細胞屏障功能。SIRT1是去乙酰化酶家族成員，通過激活過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活劑-1α（PGC-1α）參與調節組蛋白去乙酰化酶與mtDNA結合活性，參與細胞糖脂代謝、DNA損傷修復、細胞周期控制，抑制細胞凋亡和延長細胞壽命[32]。表皮生長因子受體（EGFR）是一種跨膜糖蛋白，可誘導受體二聚和酪氨酸自磷酸化，從而導致細胞增殖，具有神經保護作用，其下調可能與AD有關[33]。PIK3CA是一個能夠磷酸化磷酸肌醇環3’OH的脂質激酶家族。其負責協調多種細胞功能，包括增殖和存活。PIK3CB在真核細胞外膜受體的信號通路中起著重要作用，并因其催化亞基而得名。編碼的蛋白是PI3Kbeta（PI3Kβ）的催化亞基。PI3KB已被證明是中性粒細胞激活途徑的一部分，中性粒細胞在損傷或感染部位會結合免疫復合物。NOS2是一種活性自由基，在神經傳遞、抗菌和抗腫瘤等多個過程中發揮生物介質的作用。MAPK3基因編碼MAP激酶，MAP激酶參與多種細胞過程，是tau蛋白激酶的一種[34]，tau蛋白異常過度磷酸化是AD主要的發病機制之一，tau蛋白是腦內一種微管相關蛋白，受蛋白激酶（磷酸化）和蛋白磷酸酯酶（脫磷酸化）的調節，tau蛋白功能異常改變可能會導致神經元功能障礙和凋亡[35]。推測黃精丸可能通過降低MAPK的表達，從而減少tau蛋白的形成，減輕神經退行性變。

KEGG富集分析顯示與黃精丸治療AD相關的有癌癥信號通路、代謝通路、PI3K-Akt信號通路、神經退行性性變信號通路、AD等。

本研究應用網絡藥理學的方法，結果顯示黃精丸對AD的調控是通過多成分-多靶點-多途徑的方式，為進一步研究提供了理論參考。后期可在藥效學和細胞水平層面進行研究，以期進一步明確黃精丸防治AD的物質基礎與作用機制。