不同滅菌方法對(duì)檀香清咽片生藥粉滅菌效果及主要成分含量的影響

陳鳳英 萬 丹 邵國強(qiáng) 李躍輝 李鵬輝 扎西次仁 達(dá)瓦桑珠▲

1.湖南省澧縣中醫(yī)醫(yī)院，湖南澧縣 415500；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南長沙 410013；3.西藏自治區(qū)山南市藏醫(yī)醫(yī)院，西藏山南 856100

檀香清咽片是藏醫(yī)專家加央倫珠從眾多藏醫(yī)經(jīng)著中進(jìn)行篩選，經(jīng)多年臨床實(shí)踐提煉而成，由檀香、青藏龍膽、秦艽花等六味藥組成，具有清熱清肺、止咳化痰、解毒利咽功效，用于咽喉炎、支氣管炎和呼吸道感染引起的咳嗽、咳痰、聲音嘶啞、咽喉腫痛、胸背疼痛和氣喘，也用于潤喉亮嗓。臨床檀香清咽方（堆慈巧門泥巴丸）原以藥材粉碎后制成丸劑入藥，應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)丸劑溶散性較差，故對(duì)其進(jìn)行了工藝改進(jìn)研究，制成片劑入藥。

滅菌工藝作為影響藥品質(zhì)量的重要因素，往往會(huì)影響藥品的安全性、有效性和穩(wěn)定性[1]。中藥及其制劑滅菌工藝方法很多，包括傳統(tǒng)的濕熱滅菌[2]、干熱滅菌等，現(xiàn)代則主要包括輻射滅菌、微波滅菌和乙醇滅菌等[3]。目前，在中藥中運(yùn)用較多的滅菌方法為濕熱滅菌和輻照滅菌[4]，因檀香清咽片中主要藥效成分為揮發(fā)油和龍膽苦苷，干熱滅菌不適用于含揮發(fā)油等熱敏感藥材[5]，含龍膽苦苷的藥材不允許使用60Co輻照滅菌[6]，故本實(shí)驗(yàn)以檀香清咽片生藥粉為研究對(duì)象，建立龍膽苦苷的含量測定方法，以滅菌率、揮發(fā)油和龍膽苦苷含量為考察指標(biāo)，考察濕熱滅菌、微波滅菌、乙醇滅菌3種滅菌方法對(duì)檀香清咽片生藥粉的影響，篩選出有效、對(duì)藥效成分破壞較小的滅菌方法，為檀香清咽片的生產(chǎn)工藝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Thermo UltiMate 3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher）；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；M1-L213B美的微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）；XPE105電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；KQ3200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

檀香、秦艽花、青藏龍膽等飲片均由西藏山南市藏醫(yī)醫(yī)院提供，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院生藥室鑒定均符合規(guī)定；龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)：110770-201918，純度為97.1%）由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈（色譜級(jí)，貨號(hào)：34851）由Sigma提供，其他試劑為分析級(jí)試劑，水為純化水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 龍膽苦苷的含量測定 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇∶0.1%磷酸溶液（20∶80）為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30℃。

對(duì)照品溶液的制備：取龍膽苦苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.2 mg/ml的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取滅菌前的檀香清咽片生藥粉約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，取出后放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2 揮發(fā)油的含量測定 稱取檀香清咽片生藥粉100 g，稱定重量（準(zhǔn)確至0.01 g），裝入2000 ml圓底燒瓶中，加入10倍量水與玻璃珠數(shù)粒，振搖混合后，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管。自冷凝管上端加水使充滿揮發(fā)油測定器的刻度部分，并溢流入燒瓶時(shí)為止，同時(shí)自冷凝管上端加乙醚2 ml，置電熱套中緩慢加熱至沸，并保持微沸約5 h，停止加熱，放置1 h以上，放出乙醚層，將乙醚液置于已恒重的稱量瓶中，在60℃以下?lián)]干，稱定稱量瓶的重量，然后計(jì)算出揮發(fā)油的含量（%）。

1.3.3 滅菌率測定[7]采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)制備的樣品菌總數(shù)進(jìn)行測定，參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部1105通則[8]項(xiàng)下的非無菌產(chǎn)品微生物限度檢測法，計(jì)算滅菌率。

1.3.4 檀香清咽片生藥粉滅菌方法

1.3.4.1 滅菌前樣品的制備 按處方量比例稱取檀香、秦艽花、青藏龍膽等飲片，粉碎過100目篩，制得檀香清咽片生藥粉，備用。

1.3.4.2 濕熱滅菌 按《中華人民共和國藥典》2020年版四部1421通則[8]項(xiàng)下的濕熱滅菌法，檀香清咽生藥粉200 g，均勻平鋪于托盤中，用牛皮紙包裹放置于立式蒸汽滅菌柜中，在121℃，15 min條件下進(jìn)行滅菌。之后，將滅菌后的生藥粉放入無菌真空干燥箱中，設(shè)置溫度為60℃，真空抽濾2 h后密封樣品。

1.3.4.3 微波滅菌 取檀香清咽片生藥粉200 g，均勻平鋪于托盤中，用牛皮紙包裹放置于微波爐中，在高火1 min條件下進(jìn)行滅菌，滅菌后的樣品密封。

1.3.4.4 乙醇滅菌 稱取檀香清咽片生藥粉200 g，量取75%乙醇，用量為物料的20%，將兩者混合均勻后置于具塞錐形瓶中，放入60℃的恒溫干燥箱，放置1.5 h，取出，將滅菌好的生藥粉放入無菌真空干燥箱中，設(shè)置溫度為60℃，真空抽濾2 h后密封樣品。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

稱取龍膽苦苷適量，加甲醇稀釋制成一系列濃度的對(duì)照品溶液，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5 μl，記錄其峰面積，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：Y=0.1096x-0.1126，r=0.9992；表明龍膽苦苷在60.74576～607.4576μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液5 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定樣品中龍膽苦苷峰面積，RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品樣品6份，按照1.3.1項(xiàng)下制備供試品溶液的方法制備供試品溶液，測定樣品含量，RSD為1.04%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品適量，分別于制備后0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，測定其峰面積，RSD為0.66%，表明本方法穩(wěn)定性較好。

2.5 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的檀香清咽片生藥粉9份，研細(xì)，取約2.5 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別加入低、中、高濃度對(duì)照品，精密加入80%甲醇50 ml，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備，按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，龍膽苦苷回收率為100.77%，RSD為2.47%。見表1。

表1 檀香清咽片加樣回收率試驗(yàn)

2.6 不同滅菌方法對(duì)檀香清咽片生藥粉滅菌率、揮發(fā)油、龍膽苦苷的影響

將滅菌前后的樣品依次進(jìn)行微生物限度、揮發(fā)油和龍膽苦苷含量測定，結(jié)果表明，不同的滅菌方法下檀香清咽片中揮發(fā)油及龍膽苦苷含量差異較大，微波滅菌與乙醇滅菌的檀香清咽片中揮發(fā)油含量與龍膽苦苷含量最高，而濕熱滅菌的檀香清咽片中揮發(fā)油含量與龍膽苦苷最低，但從滅菌率看微波滅菌未達(dá)到《中華人民共和國藥典》1107通則[8]中非無菌藥用原料的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，故優(yōu)選滅菌方式為乙醇滅菌。見表2，圖1。

圖1 不同滅菌方法處理后樣品高效液相色譜（HPLC）圖

3 討論

龍膽苦苷為青藏龍膽、秦艽花的主要成分[9-10]，具有抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、抗細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等多種藥理作用[11-15]。有研究表明秦艽和龍膽經(jīng)輻照滅菌后會(huì)降低龍膽苦苷含量并影響藥效作用[16]，國家食品藥品監(jiān)督管理總局于2005年發(fā)布的《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》中規(guī)定“龍膽、秦艽藥材、飲片、藥粉及含有龍膽、秦艽的半成品原粉不得輻照”，亦有研究表明經(jīng)濕熱、干熱滅菌處理后對(duì)龍膽、秦艽藥材中龍膽苦苷含量有影響[17]。由此可見，不同的滅菌方法對(duì)本品的藥效成分有很大的影響，故本實(shí)驗(yàn)建立龍膽苦苷含量測定方法，以加強(qiáng)產(chǎn)品生產(chǎn)過程監(jiān)測，穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，濕熱滅菌及乙醇滅菌處理的樣品滅菌率在99%以上，而微波滅菌未達(dá)到《中華人民共和國藥典》通則1107中非無菌藥用原料的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，說明以滅菌率為指標(biāo)，乙醇滅菌與濕熱滅菌效果相當(dāng)。但2種滅菌方法處理的樣品揮發(fā)油提取率及龍膽苦苷含量存在較大差異，其中采用濕熱滅菌時(shí)，與未處理樣品相比揮發(fā)油提取率下降了68.42%，龍膽苦苷的含量降低了44.18%，而乙醇滅菌處理的樣品較未處理樣品的揮發(fā)油提取率、龍膽苦苷含量無明顯差異。這可能是濕熱滅菌過程中，高溫條件下導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分揮發(fā)，而乙醇滅菌過程中，滅菌溫度控制在60℃，不易導(dǎo)致?lián)]發(fā)油揮發(fā)，更利于最大程度保留產(chǎn)品有效成分。乙醇滅菌技術(shù)是一種綠色環(huán)保的新型滅菌工藝[18]，具有較強(qiáng)的穿透力[19]，是利用乙醇滲透至微生物內(nèi)使蛋白質(zhì)變性的原理達(dá)到滅菌的目的。目前，已有設(shè)備廠家研制了乙醇滅菌器[20]，并在中藥飲片滅菌過程中運(yùn)用，得到了較好的滅菌效果，這也為本品的工業(yè)化生產(chǎn)提供了設(shè)備保障。本品還有待進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)，驗(yàn)證方法的可行性。