響應面法優化黃山石耳多糖提取工藝

蘇 超，蔡為榮，丁伯樂，張冬冬，徐 迪，張 爽

(1.蕪湖職業技術學院蕪湖市生命健康工程技術研究中心，安徽蕪湖 241000；2.安徽工程大學生物與食品工程學院，安徽蕪湖 241000)

0 引言

石耳(UmbilicariaEsculenta)是地衣門石耳科植物，又名石木耳、巖菇、石壁花，因其形狀似耳又生長在山間陰暗潮濕的石縫中而得名，主要分布在安徽、浙江、陜西、東北長白山等海拔較高的地區[1-2].據《本草綱目》記載，石耳“性甘平無毒，能明目益精”，具有養陰潤肺、清熱解毒和涼血止血的作用[3-4].近年來的研究表明，石耳等多糖具有免疫調節、抗病毒及抗癌、降血糖、抗氧化、抗凝血、抗癌等生理活性作用[5-11].石耳多糖生理活性及開發利用受到眾多食品、藥品、保健品等科技工作者的關注[8-11].

報道的石耳多糖提取方法主要是基于單因素試驗和正交試驗設計方法上的水提醇沉法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等[12-15].響應面分析法(RSM)系采用多元二次回歸方程作為函數估計的的工具，來擬合多因子實驗中的因素和響應值之間的函數關系，通過對數學模型的方差分析尋求最佳工藝參數的一種有效方法[16].相比過去廣為使用的“正交試驗設計”，它具有試驗周期短，計算簡便、快捷等優點.本研究選擇響應面分析法優化石耳多糖的提取工藝，旨在為石耳多糖的工業生產和深加工提供有益參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石耳UmbilicariaEsculenta(采自于安徽黃山地區)；丙酮、苯酚、無水乙醇(分析純，南京試劑有限公司)；葡萄糖、濃硫酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)

1.2 主要儀器與設備

UVmini-1280紫外可見分光光度計(日本島津)；RE-85Z旋轉蒸發器(上海青浦滬西儀器廠)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(常州天瑞儀器有限公司)；SHB循環水式真空泵(鄭州市上街華科儀器廠)；真空冷凍干燥機(美國SIM公司)；L-550離心機(湘儀離心機有限公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 黃山石耳多糖的提取 將黃山石耳于60 ℃烘干，用粉碎機將其粉碎后過100目篩保存備用.稱取石耳粉末，按單因素實驗或響應面設計(表1)提取條件提取石耳粗多糖.提取液通過抽濾、濃縮后制取粗多糖濃縮液，然后加入4倍體積的無水乙醇置于冰箱中24 h進行沉淀.沉淀完成后的溶液經5 000 rpm離心10 min后，對所得沉淀物用少量無水乙醇、丙酮洗滌、無水乙醚2次，加水復溶后用旋轉蒸發除去酒精，備用.

1.3.2 黃山石耳多糖含量的測定 采用改良苯酚-硫酸法[17]測定多糖的含量，用紫外可見分光光度計測定波長在490 nm處的吸光度，繪制標準曲線，得

y=8.25x-0.0113,R2=0.998 8

(1)

其中，y為490 nm下的吸光度值，x為葡萄糖的質量濃度(mg/ml).

黃山石耳粗多糖得率為：

Y=(m/W)×100%

(2)

其中，m為多糖質量，W為原料質量.

1.3.3 黃山石耳多糖提取的單因素實驗

(1)準確稱取2.000 0 g的黃山石耳干粉，固定提取的時間為3 h，料液比為1∶40(g/ml)，選取提取溫度(55、65、75、85、95) ℃，考察提取溫度對黃山石耳多糖提取率的影響.

(2)同上，準確稱取黃山石耳干粉，固定提取的時間為3 h，提取溫度為75 ℃，選取料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)g/ml，考察料液比對黃山石耳多糖提取率的影響.

(3)同上，準確稱取黃山石耳干粉，固定提取溫度為75 ℃，料液比為1∶40，考察提取時間(1、2、3、4、5)h對黃山石耳多糖提取率的影響.每組試驗重復3次，取平均值.

1.3.4 響應面優化試驗 采用Box-Behnken響應面分析試驗，選擇提取溫度(Z1)、提取時間(Z2)、料液比(Z3)作為自變量，黃山石耳多糖得率(Y)為響應值，響應面試驗設計方案如表1.

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對黃山石耳多糖得率的影響 提取溫度對多糖得率的變化關系如圖1.從中可見，在55-85 ℃范圍內，黃山石耳多糖的得率隨著提取溫度的上升呈現不斷增大的的趨勢.當提取溫度為85 ℃的時候，黃山石耳多糖的得率達到最大(15.8%)，隨后多糖得率開始下降.這可能是由于提取溫度高于85 ℃時，溫度的增加可能會破壞多糖的高級結構，所以選取適宜的提取溫度為85 ℃[18].

圖1 提取溫度對黃山石耳多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on polysaccharide extraction rate

2.1.2 提取時間對黃山石耳多糖得率的影響 在浸提時間2 h以內(圖2)，黃山石耳多糖的得率呈緩慢上升的狀態.在2-3 h范圍內，黃山石耳多糖的提取率大幅度上升，原因是隨著提取時間的增加，多糖大量從細胞壁中分解出來.在3-5 h范圍內，曲線呈現下降狀態，這可能是由于提取時間過長，超出最適提取時間后，其他非多糖成分會隨著提取時間的延長而溶出，使部分多糖與非多糖成分結合，而呈得率下降[19-20].因此選擇適宜的提取時間為3 h.

圖2 提取時間對黃山石耳多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

2.1.3 料液比對黃山石耳多糖得率的影響 料液比對多糖得率的影響如圖3.在料液比1∶20(g/ml)-1∶40(g/ml)范圍內，黃山石耳多糖的得率隨著料液比的增大呈現不斷增加的的趨勢.在料液比1∶40(g/ml)-1∶60(g/ml)范圍內，曲線呈現下降狀態.料液比1∶40(g/ml)達最高，說明多糖已經達到最大溶解狀態.考慮簡化后續的實驗操作和降低能耗，故料液比選擇為1∶40(g/ml).

圖3 料液比對黃山石耳多糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharide extraction rate

2.2 響應面結果分析

2.2.2 響應面回歸模型的建立與擬合 通過Design-Expert12對表2數據進行回歸擬合，得到得到回歸方程如下：

Y=18.648+2.423 75X1+0.923 75X2-0.605X3+0.14X1X2-0.657 5X1X3-0.637 5X2X3-3.236 5X12-2.161 5X22-2.559X32

2.2.3 響應面與等高線圖分析 固定回歸方程的料液比、提取時間、提取溫度因素，分別獲得相應的另二個因素多糖得率影響曲面圖與等高線圖(圖4～圖6).由圖4～圖6中的響應面呈均拋物曲面，直觀地反映了兩兩因素對響應值的影響；等高線圖可以看出圓點附件有極值點.比較圖4、圖5和圖6可知，X1和X3兩因素的曲線較陡，X1和X2兩因素的影響次之，X2和X3兩因素影響的曲線相對變化較小.

圖4 Y=f(X1,X2)的響應面和等高線圖(X3=0)Fig.4 Response surface and contour plot of Y=f(X1,X2)，(X3=0)

圖5 Y=f(X1,X3)的響應面和等高線圖(X2=0)Fig.5 Response surface and contour plot of Y=f(X1,X3)，(X2=0)

圖6 Y=f(X2,X3)的響應面和等高線圖(X1=0)Fig.6 Response surface and contour plot of Y=f(X2,X3)，(X1=0)

2.2.4 確定最佳點與驗證 為了進一步確證最佳點的值,對回歸方程取一階偏導數等于零并整理得

2.423 75-6.473X1+0.14X2-0.657 5X3=0

(3)

0.923 75+0.14X1-4.323X2-0.637 5X3=0

(4)

-0.605-0.657 5X1-0.637 5X2-5.118X3=0

(5)

求解方程組(3)、(4)、(5)，得X1=0.400，X2=0.256，X3=-0.202，代入原變換，求解得黃山石耳多糖最優提取條件為提取溫度89 ℃，提取時間3.26 h，料液比1∶37.98 (g/ml).考慮到提取工藝的可操作性和可行性，將最佳工藝條件修正為提取溫度89 ℃，提取時間3.25 h，料液比1∶38(g/ml).

為驗證BBD的可靠性，采用上述最優提取條件進行石耳多糖提取，通過三次平行測定，測得黃山石耳多糖的得率均值為19.18%，該得率與模型預測最大值19.31%接近，兩者相對誤差小于1%，說明本響應面試驗優化黃山石耳多糖的提取工藝是可行的.

3 結論

采用水提醇沉法提取黃山石耳多糖和改良苯酚-硫酸法測量其含量，通過單因素實驗選取提取時間、液固比和提取溫度作為優化石耳多糖得率的3個因素，通過Box-Behnken實驗和響應面優化獲得最優提取工藝為提取溫度89 ℃，提取時間3.25 h，料液比1∶38(g/ml)，得率為19.31%.在此最優工藝條件下進行驗證實驗，實測值為19.18%，誤差為0.7%，響應面模型擬合成功，為黃山石耳多糖的提取提供了有益參考.