蒜片加工液原液及發酵液主要化學成分分析

劉國偉，高園園，張龍平，任艷云，李印峰，張成剛，譚 賀，李思琦，朱春雨

（濟寧市農業科學研究院，山東濟寧 272031）

0 引言

大蒜含有的揮發性化合物和非揮發性化合物具有許多殺菌、消炎、抗癌的功能性成分[1-2]。蒜片加工過程中，需要注入大量水沖洗加工刀片以保證加工產品不與刀片粘連，同時在脫水過程中要排出加工液，加工廢液中含有大量大蒜水溶性功能成分，為一種高濃度有機廢水，COD值很高，極易產生硫化物等刺激性氣體，同時造成水生生物死亡，污染環境[3]。國內外已有較多對蒜片加工廢液處理的研究方案，但對于其功能性化學成分分析、資源再次利用的研究較少[4-5]。筆者利用GC-MC（氣相色譜-質譜聯用）和UPLC-Triple-TOF/MS（高效液相色譜-電噴霧質譜聯用）技術對蒜片加工原液（未經處理的蒜片加工廢液）和發酵液（蒜片加工原液在密閉罐中接入酵母菌發酵60天）的揮發性和非揮發性主要功能性成分進行分析，旨在為其資源利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點

本研究于2017—2018 年在山東省金鄉縣濟寧市農科院大蒜試驗基地和濟寧市農業科學研究院進行。

1.2 試驗材料與儀器

1.2.2 主要儀器GC-MS 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；UPLC-Triple-TOF/MS 系統包含AcquityTMultra型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）、Triple TOF 5600+型飛行時間質譜，配有電噴霧離子源（美國AB SCIEX 公司）；Eppendorf minispan 離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2.3 氣相色譜-質譜試驗處理及條件 各取原液和發酵液樣品10 mL，分別用10 mL 乙醚催取2 次，分別合并濾液，并減壓濃縮至剩余少量液體，液體分別轉移至2 mL量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻，備用。

色譜柱Agilent HP-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm，進樣口溫度270℃，1 mL/min 恒流(He)，分流比(20:1)，升溫程序，50℃保持4 min，10℃/min 升至300℃，保持10 min。MS 檢測器溫度280℃，掃描范圍m/z（質譜掃描中質子數與電荷數的比值）30～550。

1.2.4 液相色譜-質譜試驗處理及條件 原液和發酵液各取2 mL，10000 r/min 離心20 min，取上清液用于測試。流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為0.1%甲酸乙腈，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm。色譜柱安捷倫ZORBAX-SB C18(100 mm×4.6 mm i.d.，1.8 μm)，進樣量5 μL，柱溫箱30℃。表1 為流動相為0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈2 種不同極性的溶劑，通過改變流動相中各溶劑組成的比例改變流動相的極性，使每個流出的組分都有合適的容量因子k，從而使樣品中的所有組分可在最短時間內實現最佳分離。

表1 梯度洗脫程序

UPLC-Triple-TOF 5600+飛行時間液質聯用儀：負離子掃描模式，掃描范圍m/z 100～1500，霧化氣(GS1)50 psi，霧化氣(GS2)50 psi，氣簾氣(CUR)35 psi，離子源溫度(TEM)550℃，離子源電壓(IS)-4500 V，一級掃描去簇電壓(DP)100 V、聚焦電壓(CE)10 V；二級掃描使用TOF MS～ Product Ion～ IDA 模式采集質譜數據，CID能量為-20、-40、-60 V，進樣前用CDS 泵做質量軸校正，使質量軸誤差小于0.0002%。

2 結果與分析

2.1 蒜片加工原液和發酵液易揮發性成分分析

對蒜片加工原液和發酵液的易揮發性成分在HP-5色譜柱上進行GC-MS測定，得到原液和發酵液的氣質色譜圖，見圖1～2。

圖1 蒜片加工原液氣質色譜圖

圖2 蒜片加工發酵液氣質色譜圖

原液中共檢測到易揮發性成分54種，包括含硫化合物（17 種）、芳香類化合物（14 種）、烴類化合物（7種）、酯類化合物（5 種）、酸類化合物（2 種）、醇類化合物（2 種）、酮類化合物（1 種）、酚類化合物（1 種）、其他化合物（5 種）。定量分析使用Hewlett-Parkard 軟件按面積歸一化法計算各組分相對百分含量，根據計算出的相對含量進行排序，相對含量較大的化合物（表2）為二烯丙基二硫化物、2-乙烯基-4H-1,3-二噻烯、2,6-二叔丁基對甲酚、鄰苯二甲酸二丁酯、4-甲基-2,4-雙(對羥基苯基)戊-1-烯。其中二烯丙基二硫化物、2-乙烯基-4H-1,3-二噻烯為具有生物活性的二硫化物，在蒜片加工原液中含量較多。

進行邊坡減載技術，降低坡面的承載力，增加邊坡建設的堅固性。我國目前常用的邊坡減載技術主要分為兩種：削坡減載和削頭減載。削坡減載主要是減少坡面的土，降低坡面高度，使坡度放緩；削頭技術主要是對坡體的上部分的巖石結構進行削除處理，降低邊坡的整體高度，降低坡面的緩度[5]。目前，這兩種減載技術中，削頭技術被我國建筑業普遍運用，因為削頭減載技術受附近建筑物的干擾程度較小，實施起來不太受限制，可以運用在大多數邊坡工程中，因此比較受行業歡迎。

發酵液中共檢測到易揮發性成分122 種，包括酸類化合物（37 種）、酯類化合物（16 種）、芳香類化合物（11 種）、醇類化合物（10 種）、含硫化合物（8 種）、酮類化合物（8 種）、酚類化合物（7 種）、烴類化合物（6 種）、醚類化合物（2種）、醛類化合物（1種）、其他化合物（16種）。定量分析使用Hewlett-Parkard 軟件按面積歸一化法計算各組分相對百分含量，根據計算出的相對含量進行排序，相對含量較大的化合物（表2）為正丁酸、正戊酸、甲基-L-吡喃阿拉伯糖苷、環丁基己基酯、苯乙酸、氫化肉桂酸、鄰苯二甲酸二丁酯。

表2 蒜片加工原液及發酵液主要可揮發性化學成分及其相對含量

2.2 蒜片加工原液和發酵液難揮發性成分分析

經UPLC-Q-TOF-MS 分析，得到原液和發酵液總離子流圖（圖3～4），根據質譜提供化合物信息以及相關的文獻數據，共鑒定出4種主要化合物結構，其中原液2種、發酵液2種。

圖3 蒜片加工原液液質色譜圖

2.2.1 蒜片加工原液難揮發主要化學成分分析

（1）化合物1解析。該化合物的出峰時間為7.099 min（被分離樣品組分從進樣開始到柱后出現該組分濃度極大值時的時間），[M-H]-為m/z 289.0857，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C11H18N2O5S，根據二級質譜171、153、128、73（質譜掃描中質子數與電荷數的比值）等氨基酸類化合物的特征離子，通過Scifinder 和Reaxy 數據庫檢索和推測該化合物為γ-L-谷氨酰-S-(2-丙烯基)-L-半胱氨酸[γ-L-glutamyl-S-(2-propenyl)-L-cysteine]。

（2）化合物2解析。該化合物的出峰時間為9.583 min，[M-H]-為m/z293.1137，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C14H18N2O5，根據二級質譜164、147（質譜掃描中質子數與電荷數的比值）等氨基酸類化合物的特征離子，通過Scifinder 和Reaxy 數據庫檢索和推測該化合物為L-g-谷氨酰-L-苯丙氨酸(L-g-Glutamyl-Lphenylalanine)。

圖4 蒜片加工發酵液液質色譜圖

2.2.2 蒜片加工發酵液難揮發主要化學成分分析

（1）化合物1解析。該化合物的出峰時間為14.48 min，[M-H]-為m/z 253.0724，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C12H14O6，根據二級質譜121、105、77（質譜掃描中質子數與電荷數的比值）等酚酸類化合物的特征離子，通過Scifinder 和Reaxy 數據庫檢索和推測該化合物為illisimoid A。

（2）化合物2 解析。該化合物的出峰時間為24.211 min，[M-H]-為m/z 305.0699，根據高分辨質譜結果擬合的分子式為C12H18O7S，根據二級質譜79.9、225、210（質譜掃描中質子數與電荷數的比值）等磺酸酯類化合物的特征離子，通過Scifinder 和Reaxy 數據庫檢索和推測該化合物為5'-(羥基磺酰氧基)茉莉酸[5'-(hydroxysulphonyloxy)jasmonic acid]。

3 蒜片加工原液和發酵液對蔬菜病害的影響

根據前人研究，大蒜中含有較多抑菌、殺菌的活性成分，基于此，于2019 年在金鄉縣濟寧市農科院大蒜試驗基地，采用本研究中蒜片加工原液和發酵液兌水稀釋成100倍液，于大白菜幼苗期、蓮座期、結球期，胡蘿卜幼苗期、葉生長盛期和肉質根生長期，芥菜幼苗期、葉生長盛期和抽薹期每隔10～15 天噴施于作物根部周邊土壤，對照為常規井水灌溉、不施農藥處理。于大白菜結球后期、胡蘿卜肉質根生長期和芥菜抽薹期調查病害的病株率。

由表3可知，與對照相比，蒜片加工原液能夠顯著降低大白菜軟腐病、霜霉病，胡蘿卜和芥菜軟腐病的病株率，表明蒜片加工原液能夠顯著抑制大白菜、胡蘿卜和芥菜真菌病害的發病率，而蒜片加工發酵液與對照之間差異不顯著，表明發酵液中不含有或含有較少抑制十字花科蔬菜真菌病害病原菌的成分。

表3 蒜片加工原液和發酵液對十字花科蔬菜主要病害的影響 %

4 結論

4.1 蒜片加工原液和發酵液中易揮發性成分分析

蒜片加工形成的廢水為富含COD 和有機硫化物的有機廢水，沒有有毒物質，但是直接排入其他水源中會消耗水中大量的溶解氧，造成水源中的氧氣迅速消耗，水生生物缺氧，同時硫化物發酵產生臭氣，形成水體污染。由于蒜片加工液中含有大量的滅菌物質，其他廢液處理中常有硝化細菌、反硝化細菌、芽孢桿菌等，而蒜片加工液對以上部分菌種具有殺滅作用，處理起來較為棘手。據報道，現已有用厭氧折流板反應器-曝氣生物濾池組合工藝來處理蒜片加工廢水等方法[6]。

蒜片廢液內有機物質來源于大蒜，大蒜富含各種有機物質，因而挖掘利用大量蒜片加工廢液中的有用物質對于保護環境、變廢為寶等都具有重要意義。

本研究表明，蒜片加工原液中種類較多的易揮發性化合物為含硫化合物，其中含量較多的二烯丙基二硫化物、2-乙烯基-4H-1,3-二噻烯為具有生物活性的二硫化物，其在大蒜中含量同樣較多，據研究，天然有機硫化物對動物體內的致癌物質有防御作用，抗癌作用主要依賴于烯丙基和巰基團，抗癌作用隨著硫原子數目的增加而增強?；诖耍馄庸ぎa生的大量原液可以作為大蒜鱗莖提取含硫化合物等生物活性物質的代替品，這對于減少環境污染、變廢為寶等具有重要意義。

蒜片加工發酵液中易揮發性成分主要為甲基-L-吡喃阿拉伯糖苷以及正丁酸、正戊酸等酸類物質，多為化工用品原料或中間物質。

4.2 蒜片加工原液和發酵液中難揮發性成分分析

經檢測，γ-L-谷氨酰-S-(2-丙烯基)-L-半胱氨酸(GSAC)在蒜片加工原液中含量較多，GSAC是大蒜中含量較多的非揮發性二肽化合物，是合成大蒜素等功能性成分的主要底物[7-14]，沒有大蒜的強烈刺激氣味，且水溶性好，易于加工。相關學者研究證實，GSAC是大蒜中的一種活性成分，能夠抑制肝纖維化，GSAC 在體外能夠抑制肝星狀細胞增殖，對肝形狀細胞具有抑制作用[15-18]。

蒜片加工發酵液中難揮發性成分主要為酚酸類化合物illisimoid A 以及5'-(羥基磺酰氧基)茉莉酸，其中illisimoid 經研究為一種神經保護天然物資，對SHSY5Y細胞中氧葡萄糖剝奪誘導的細胞損傷起到神經保護作用，相關學者已在八角茴香果實中分離得到。

5 討論

研究證實，大蒜鱗莖的浸提物活性成分主要為二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)、二甲基二硫醚(DMDS)等有機硫化物。有機硫化物具有較強的抗菌消炎作用，是當前發現的天然植物中抗菌作用最強的一種，對多種真菌、桿菌、球菌、病毒、陰性細菌及革蘭氏陽性菌等有明顯抑制和殺滅作用。蒜片加工原液中富含二烯丙基二硫化物、2-乙烯基-4H-1,3-二噻烯等為具有生物活性的二硫化物，可以作為提取相應生物活性物質的基礎來源。

程智慧等[19]研究發現大蒜鱗莖粗提物對黃瓜枯萎病菌具有抑制作用。祁高展等[20]研究發現大蒜鱗莖浸提液中活性成分二烯丙基三硫化物和二甲基二硫醚對蘋果炭疽病菌絲生長和孢子萌發均具有抑制活性，在質量濃度為200 mg/mL時其對病原物菌絲生長和孢子萌發的抑制率均達到100%。其他學者也有相關研究證實大蒜提取物黃瓜、番茄、辣椒等病害具有抑制作用[21-27]。筆者采用蒜片加工廢液稀釋后隨水澆灌多種十字花科蔬菜，初步研究表明，與對照普通灌溉相比，十字花科的真菌性病害顯著減少，以往研究大多認為，大蒜鱗莖產生的浸提液對蔬菜等作物病害具有抑制作用，本研究以蒜片加工液為原料，證實其同樣對相關病害具有抑制作用，這為蒜片加工企業產生的大量廢液處理提供了一條突破性的利用途徑，但本研究結果的試驗時間相對較短，還需要進一步驗證。