百合GBSS基因RNAi載體構(gòu)建

張進(jìn)忠

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，南寧 530007）

0 引言

食用百合鱗莖富含淀粉、營養(yǎng)豐富；部分品種藥食同源，富含生物堿、多糖、皂苷類等活性成分，具有抗氧化、抗疲勞、抗癌、降血糖、鎮(zhèn)靜催眠、免疫調(diào)節(jié)等作用[1-2]，是膳食藥用佳品。百合鱗莖籽球質(zhì)量對后期商品種球的生長影響較大，從小鱗莖生長到商品種球的形成一般需2～3 年時間，因此百合鱗莖籽球高質(zhì)量繁殖非常重要。百合母鱗片通過淀粉代謝途徑為其近鱗盤基端發(fā)育形成的小鱗莖提供碳源，小鱗莖再通過小分子糖到淀粉的轉(zhuǎn)變積累逐漸膨大生長[3-4]，小鱗莖的鱗片數(shù)增加、體積增大表明其以淀粉為主的營養(yǎng)積累增加，為后期生長提供了較多的能量物質(zhì)。營養(yǎng)養(yǎng)分積累較少的再生鱗莖通常第一年不能形成主莖稈而成為基葉苗[3]，延緩了種植生產(chǎn)。研究百合淀粉合成代謝、調(diào)控淀粉合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)機(jī)制對于理解鱗莖籽球的形成與膨大發(fā)育具有重要意義，據(jù)此開發(fā)出鱗莖籽球的生產(chǎn)調(diào)節(jié)技術(shù)對于百合種植產(chǎn)業(yè)更具重大意義。

在淀粉合成關(guān)鍵酶中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是淀粉合成的限速酶[5]，催化反應(yīng)生成的ADPG作為顆粒結(jié)合淀粉合成酶(GBSS)等相關(guān)酶的底物形成糖苷鍵延長合成淀粉。所以GBSS對于作物淀粉的形成與積累非常關(guān)鍵，對其編碼基因的表達(dá)調(diào)節(jié)進(jìn)行相關(guān)研究，探索出能提高淀粉產(chǎn)量、改善淀粉品質(zhì)的技術(shù)有利于作物生產(chǎn)的提質(zhì)增效。GBSS具有g(shù)lgA保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是淀粉合成酶的特征結(jié)構(gòu)，作用底物為ADPG，具有GT1_Glycogen_synthase_DULL1_like保守結(jié)構(gòu)域，該域結(jié)構(gòu)包含ADP-binding pocket 與同二聚體界面2個特征位點(diǎn)，前者為化學(xué)結(jié)合位點(diǎn)，可與ADP 結(jié)合的一些殘基間接結(jié)合，后者為多肽結(jié)合位點(diǎn)。該家族蛋白與糖基轉(zhuǎn)移酶GT1家族關(guān)系密切，以ADPG 為底物，催化形成α-1,4-糖苷鍵，實(shí)現(xiàn)葡萄糖骨架的形成和延伸。

研究發(fā)現(xiàn)，玉米GBSS胚乳特異啟動子受ABA 正調(diào)控，對誘導(dǎo)培養(yǎng)的玉米胚乳進(jìn)行ABA 處理后，其表達(dá)量明顯提高，促進(jìn)了GBSS表達(dá)，而GA3處理后的該啟動子表達(dá)量下降[6]，這為通過激素等外界因子調(diào)控基因表達(dá)而改變作物淀粉品質(zhì)提供了途徑。在對作物進(jìn)行GBSS反義表達(dá)或抑制表達(dá)中，人們發(fā)現(xiàn)其直鏈淀粉含量急劇下降[7-9]，例如抑制水稻GBSSⅠ表達(dá)導(dǎo)致胚乳直鏈淀粉大幅度降低[10]；利用RNAi 技術(shù)沉默GBSSⅠ在小麥中的表達(dá)導(dǎo)致了GBSSⅠ酶活下降及直鏈淀粉的大幅度下降[11]；這為GBSS 具有催化直鏈淀粉合成的生物學(xué)功能提供了證據(jù)。食用百合淀粉合酶相關(guān)基因研究較少，在其鱗莖形成、膨大發(fā)育繁殖過程中伴隨著淀粉的大量合成積累，為其后續(xù)的營養(yǎng)生長積蓄能量物質(zhì)；因此研究GBSS 調(diào)控淀粉合成代謝有助于理解百合鱗莖形成發(fā)育機(jī)制，也對研發(fā)調(diào)控百合淀粉含量與品質(zhì)的生產(chǎn)技術(shù)提供參考。本研究利用Gateway 技術(shù)，構(gòu)建GBSS保守區(qū)域干擾表達(dá)載體，旨在為進(jìn)一步開展基因沉默、研究該基因功能提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 蘭州百合(Lilium davidiivar.unicolor)組培苗培養(yǎng)于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒載體 大腸桿菌DH5α，克隆載體pDONR221，目的載體pJawohl8-RNAi，具有GBSS保守區(qū)域（登錄號KP751445）的pMD18-T克隆質(zhì)粒由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2.3 主要試劑Gateway?LR Clonase?enzyme mix，規(guī)格20T，貨號11791019(Invitrogen)；5×BP Clonase enzyme mix，Gateway BP Clonase II enzyme mix，規(guī)格100T，貨號11789100(Invitrogen)；RNA提取試劑Trizol購于Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購于Fermentas；Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶購自TAKARA，DNA 凝膠回收試劑盒AP-GX-50 購于Axygen；其余常規(guī)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 目的序列的擴(kuò)增 根據(jù)基因序列，選擇保守區(qū)域300 bp作為干擾片段，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；以帶有目的片段的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。GBSS I F：5’-ATTCggtaccGGGAGGAAAATCAA TTGGATGAAG-3’，酶切位點(diǎn)Acc65I；GBSS I R：5’-CGCActcgagTGTGGAATGTCTGGGTCAACAGGA-3’酶切位點(diǎn)XhoI。

1.2.2 構(gòu)建入門克隆 按文獻(xiàn)[12]克隆含有attB接頭的干擾片段attB-PCR產(chǎn)物。

（1）BP 重組反應(yīng)。attB-PCR 產(chǎn)物5 μL(>10 ng)，pDONR221(150 ng/μL)1 μL，5×BP Clonase enzyme mix 2 μL，TE Buffer 4 μL；反應(yīng)體系放于25℃下溫育10 h，反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)為含有目的片段的入門克隆pDONR221-GBSS。

（2）轉(zhuǎn)化。取100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入至上述反應(yīng)體系中，冰上30 min，然后42℃保持90 s，迅速放于冰上2 min，涂布到含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)15 h。將LB 平板倒置，常溫下隨機(jī)挑選平板上的陽性克隆，PCR 法篩選重組克隆，凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3 構(gòu)建干擾表達(dá)載體

（1）LR重組反應(yīng)、將pDONR221-GBSS(≥100 ng/μL)3 μL、LR ClonaseTMReaction Buffer 4 μL、5×LR ClonaseTMenzyme mix 4 μL、pJawohl8-RNAi(≥300 ng/μL)1 μL、ddH2O 8 μL于冰盒中溶解混勻，混勻后短暫離心，置于25℃下孵育過夜。反應(yīng)物應(yīng)為含有正反向目的片段且中間有內(nèi)含子的干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-GBSS，取5 μL用于轉(zhuǎn)化。

（2）轉(zhuǎn)化。取100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入至上述反應(yīng)體系中，冰上孵育30 min，然后42℃90 s，迅速回放于冰上2 min，涂布到含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)15 h。將LB 平板倒置，常溫下隨機(jī)挑選平板上的陽性克隆，PCR 法篩選重組克隆，電泳檢測PCR 產(chǎn)物，選擇出含目的片段的陽性克隆，再進(jìn)行Acc65I、NheI與SpeI酶切鑒定。挑選陽性克隆接種到5 mL 含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)15 h，提取質(zhì)粒測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的序列克隆

選定的序列是GBSS基因保守區(qū)域300 bp 序列。圖1 泳道1、2 顯示的為PCR 擴(kuò)增出來的片段條帶，該條帶約為300 bp，符合預(yù)期大小，表明擴(kuò)增出了所選的GBSS基因干擾片段。

圖1 目的基因GBSS干擾片段

2.2 GBSS干擾片段裝入到入門載體后菌液PCR

attB-GBSS與pDONR221 進(jìn)行BP 反應(yīng)，發(fā)生特異性位點(diǎn)重組形成入門克隆pDONR221-GBSS與副產(chǎn)物。圖2 為BP 反應(yīng)后的菌液PCR，其泳道2、3 具有約400 bp（目的片段與接頭引物）的清晰條帶，表明入門載體pDONR221-GBSS已構(gòu)建成功。

圖2 BP反應(yīng)后菌液PCR結(jié)果

2.3 LR 反應(yīng)后干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-GBSS 酶切驗(yàn)證

入門載體pDONR221-GBSS與目標(biāo)載體pJawohl8-RNAi的LR反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌培養(yǎng)，干擾序列轉(zhuǎn)入到目的載體，形成了所需的干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-GBSS，為進(jìn)一步確定結(jié)果可靠性，需做酶切實(shí)驗(yàn)檢測。

選擇重組質(zhì)粒載體上Acc65I、NheI與SpeI酶切驗(yàn)證。如圖3所示，泳道1為pJawohl8-RNAi目的載體約9000 bp；泳道2 為pJawohl8-RNAi 的NheI 與SpeI 雙酶切，顯示有約4300 bp 與4700 bp 條帶，NheI 與SpeI 分別在質(zhì)粒的8084 bp 與3803 bp 位置，其計(jì)算結(jié)果與條帶大小相符，因其長度大小太相近，2條條帶接近在一起；泳道3為pJawohl8-RNAi的Acc65I酶切，因該載體無Acc65I 酶切位點(diǎn)，所以還是呈現(xiàn)與泳道1 大小一樣的條帶，所構(gòu)建的pJawohl8-RNAi-GBSS干擾表達(dá)載體，其大小約6500 bp；泳道4 為pJawohl8-RNAi-GBSS干擾表達(dá)載體NheI 與SpeI 雙酶切結(jié)果，考慮到上述NheI與SpeI酶切位點(diǎn)，所以應(yīng)具有約4280 bp與2260 bp條帶，泳道4 條帶與結(jié)果相符；泳道5 為pJawohl8-RNAi-GBSS干擾表達(dá)載體Acc65I酶切結(jié)果，應(yīng)具有約1020 bp與5500 bp條帶，其大小與結(jié)果一致。泳道4、5的結(jié)果表明pJawohl8-RNAi-GBSS干擾表達(dá)載體構(gòu)建成功。圖4 顯示了最終成功構(gòu)建的pJawohl8-RNAi-GBSS質(zhì)粒圖譜。

圖3 干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-GBSS酶切結(jié)果

圖4 最終構(gòu)建的pJawohl8-RNAi-GBSS質(zhì)粒圖譜

2.4 干擾表達(dá)載體pJawohl8-RNAi-GBSS中目的片段測序結(jié)果

圖5 為GBSS基因中300 bp 測序峰圖結(jié)果，波峰、波谷清晰，峰與峰之間距離均勻，底部沒有雜峰干擾，結(jié)果較好。

圖5 目的干擾片段測序結(jié)果

3 討論

食用百合組培鱗莖的形成發(fā)育與膨大生長是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。生產(chǎn)上需要較大的再生鱗莖作為種植籽球，以縮短基葉苗時期，種植收獲期望較大的商品種球以增加經(jīng)濟(jì)效益，如何在籽球階段做好其膨大發(fā)育對種植產(chǎn)業(yè)顯得尤為重要。將復(fù)雜因素單一化的植物組培技術(shù)為研究百合鱗莖發(fā)育提供了良好環(huán)境。封閉的培養(yǎng)環(huán)境中百合組培苗對蔗糖碳源的吸收利用因不同調(diào)控因子對相關(guān)基因表達(dá)的影響，而使百合組培苗的生長發(fā)生方向性的變化，主要方向?yàn)橛鷤麉采康脑鲋成L與鱗莖的形成發(fā)育膨大生長，除碳源濃度因子強(qiáng)烈影響鱗莖形成與膨大外，植物生長調(diào)節(jié)劑對基因表達(dá)調(diào)控也強(qiáng)烈影響鱗莖發(fā)育。GBSS是淀粉合成途徑的主要酶類之一，其編碼基因表達(dá)差異可能會對鱗莖發(fā)育生長所需的淀粉積累產(chǎn)生影響，因此對百合GBSS基因功能通過過表達(dá)或缺失表達(dá)研究以及環(huán)境因子對其調(diào)控機(jī)理研究有助于理解百合組培鱗莖的形成發(fā)育與膨大生長。

植物GBSS基因型通常有GBSSⅠ與GBSSⅡ[9,13-16]，兩者在基因序列和表達(dá)特異性等方面具有較大的不同。GBSSⅠ與GBSSⅡ兩個異構(gòu)型分別在種子、胚、胚乳、鱗莖等存儲器官和根、莖、葉等非存儲組織營養(yǎng)器官的淀粉合成中發(fā)揮作用[17-19]。本研究中設(shè)計(jì)的干擾片段是前期實(shí)驗(yàn)中克隆到的GBSSⅠ基因保守區(qū)域（登錄號KP751445），該基因在鱗莖鱗片形成發(fā)育過程中有較高表達(dá)[20]；通過Gateway 技術(shù)成功構(gòu)建pJawohl8-RNAi-GBSS表達(dá)載體，為下一步進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化百合，干擾GBSS轉(zhuǎn)錄、鑒定相關(guān)功能提供了基礎(chǔ)。后續(xù)進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化株鑒定與功能分析將更直接闡明GBSS作用機(jī)理；同時還應(yīng)進(jìn)行過表達(dá)相關(guān)研究及調(diào)控GBSS表達(dá)差異因子研究，全面理解調(diào)控因子、基因表達(dá)、鱗莖膨大發(fā)育等之間的內(nèi)在作用機(jī)制。