基于超分子“印跡模板”整合成成分簇的龍牙百合譜量學研究

陳定芳，李文姣，田 麗，肖美鳳，秦裕輝*，賀福元，4，5*

（1.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3.湖南省中醫藥研究院，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫藥大學中醫藥超分子機理與數理特征化實驗室，湖南 長沙 410208；5.中藥藥性與藥效國家中醫藥管理局重點實驗室，湖南 長沙 410208）

在過去的數十年里，指紋圖譜作為一種穩定、有效、精確的質量表征方法，在國際上得到了廣泛認可和應用[1]。 針對中藥復雜的化學成分，指紋圖譜能將其大部分化學成分以色譜峰的形式表現出來，整個指紋圖譜表征了該樣品所含化學成分的多少和含量的大小。目前，指紋圖譜的定量分析大都是通過測定單個有效成分含量得到，然而中藥具有化學成分復雜、活性成分含量低及多成分協同發揮整體調節作用的特點，少數幾個特征峰難以代表一味中藥或者一個復方的物質基礎[2]。 本課題組前期提出，建立以QMarker 印跡性為評價指標的中藥質量評價體系[3]，根據成分群“印跡模板”印跡性作用規律分析，實現成分間印跡性作用大小的表征。 正如指紋圖譜呈現出化學成分的具相似印跡結構聚集行為，以超分子“印跡模板”為中心成簇狀分布，故宜從超分子“印跡模板”印跡性的角度來展開研究。超分子“印跡模板”屬于空間中一定的空間結構或結合位點，是指以特定模板分子為客體分子，對主體分子表現出特異選擇性或親和性的過程，屬于超分子化學中主客體作用研究范疇[4]。 具有相似“印跡模板”特征的化學成分在色譜學上表現為具有相同（似）的印跡作用，其指紋圖譜特征相同（似），在指紋圖譜相似度評價軟件中進行匹配就會出現以“印跡模板”成分簇為中心的指紋峰聚集現象，出現保留時間與匹配頻數呈凹凸狀分布，據此可用匹配頻數法進行“印跡模板”成分簇的劃分。

中藥指紋圖譜與成分含量的關系稱為譜量學，也可指成分群含量與浸出率之間的關系[5]。 中藥指紋圖譜能表征“印跡模板”成分簇種類的多少與含量的大小。 通過關聯不同批次中藥材指紋圖譜“印跡模板”成分簇總峰面積和浸出率建立譜量學方程，可以對藥材各“印跡模板”成分簇峰面積與成分含量的關系進行定量描述，相當于將中藥眾多的化學信息轉化成數理信息，能更加全面和客觀地反映出中藥的質量信息和預測化學成分含量[6]。

龍牙百合（Lilium brownie F.E. Brown var. viridulum Baker）是湖南邵陽地區特產，具有養陰潤肺、清心安神等功效，是應用廣泛的藥食同源百合品種[7]。由此基于團隊前期提出的譜量學，對中藥指紋圖譜劃分“印跡模板”成分簇，再根據朗伯-比爾定律關聯指紋圖譜“印跡模板”成分簇總峰面積與浸出率，建立二者譜量學方程，對中藥浸出率進行預測。這項研究采用龍牙百合作為研究對象，基于超分子“印跡模板”理論對譜量學進行更進一步探討和研究，為創新中藥材生產加工過程中定量分析方法提供參考和思路。

1 基本原理

1.1 中藥化學成分的色譜行為呈現超分子“印跡模板”成分簇作用規律

本課題組前期提出超分子“印跡模板”理論[8]：中藥與人體為自然界生物超分子的聚集體，各級分子按“印跡模板”有序作用。 中藥成分群進入體內按“印跡模板”進行吸收、分布、代謝和排泄而產生綜合生物藥劑學行為，具有相同（似）“印跡模板”的客體成分產生相同（似）的藥效[9]；同樣在體外色譜學上表現為具相同（似）“印跡模板”結構的化學成分，在一定的壓力和溫度下隨機與固定相基質顆粒進行結合-遷移-解結合-再結合-再遷移等印跡作用[10]，組成不同的“印跡模板”成分簇，隨后在不同極性的流動相洗脫作用下在一定的保留時間依次出峰，最終綜合印跡特征以保留時間的形式體現出來。 中藥指紋圖譜上每個峰對應一個以上化學成分，每個化學成分的“印跡模板”結構特征不同，而“印跡模板”結構特征相近的成分保留時間也相近；峰面積即表明其化學含量的高低，其受色譜條件、藥材成分相互作用等的綜合影響。因此，根據“印跡模板”特征與色譜印跡性相一致原則，眾多化學成分并不是在固定相和流動相作用下無序排列出峰，而是“印跡模板”特征相近的化學成分在相近的保留時間下出峰，在指紋圖譜上呈現為以最接近“印跡模板”結構特征成分為中心的簇狀分布，其分離度的大小表示“印跡模板”的相似程度，與匹配頻數相關。

總量統計矩法可作為一種定性、定量評價中藥印跡性的方法[11]。具體來說，它將每張完整的動態指紋圖譜看作是一個由時間變量和對應的指紋峰響應值所構成的二維圖譜[12]，按統計學原理可獲得總量零階矩（area under curve of total quantum, AUCT）、總量一階矩（mean chromatographic retention time of total quantum, MCRTT）、總量二階矩（variance of chro matographic retention time of total quantum, VCRTT）等一系列總量統計矩參數。 同時，總量統計矩具有加和性特征[13]，將整張指紋圖譜按照一定的方式分段處理，即段帶，通過計算可獲得各個段帶的總量統計矩參數。

1.2 劃分出的“印跡模板”成分簇的總峰面積與浸出率可建立譜量學關系

紫外檢測器是高效液相色譜最為常用的檢測器，適合于所有具有紫外光吸收的物質[14]。 根據朗伯-比爾定律，段帶色譜峰峰面積與濃度呈線性關系，整合后的段帶色譜峰總面積也與段帶成分總濃度呈線性關系[15]，呈現線性的疊加性，亦為式（1）和式（2）。 目前，常用的指紋圖譜分析方法有氣相色譜法、高效液相色譜法、色譜/質譜聯用分析法、毛細管電泳法、薄層色譜法、熒光分析法、標記免疫分析法（酶聯免疫方法、放射免疫技術測定法和化學發光酶免疫測定法）等[16]，其檢測器輸出的響應值與藥物質量呈線性，為式（1）。

式中：ci、Ai、Ki為單成分濃度、峰面積和響應系數，Bi為儀器測定時單成分響應常數。若整合成第m成分簇后，其色譜峰峰數目從f 到g 壓縮為1 個，則為式（2）。

式中：Cm、Am、km為按匹配頻數法劃分出的“印跡模板”成分簇的段帶總濃度、總峰面積和總響應系數，Bm為儀器測定時成分簇響應常數。 其中Ki、Km因不同的檢測器而異[17]。

據此建立段帶色譜峰總面積與浸出率的譜量學關系是指當整個指紋圖譜由n 個段帶成分簇構成，各段帶色譜峰總面積與總浸出率呈線性關系，體現線性的疊加性[18]，可得總濃度與段帶色譜峰總面積的譜量學關系，為式（3）。

式中成分簇共有n 個，CT為總成分簇濃度；BT為儀器測定時總成分簇響應常數。對劃好界值的“印跡模板”成分簇按段帶統計矩法計算出新的保留時間，而峰面積相加得新的成分簇峰面積[19]，構成體現不同批次龍牙百合“印跡模板”成分簇色譜峰表征體系，以此展開譜量學數學關系分析。

2 材料與方法

2.1 主要儀器

超高效液相色譜儀（美國Waters 公司，型號：ACQUITY UPLC H-Class）；真空冷凍干燥機（美國GOLD-SIM 公司，型號：FD5-3）；真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司，型號：DZF-6050）；低速臺式離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司，型號：TDZ4-WS）；電子天平（上海良平儀器儀表有限公司，型號：MA110）；循環水式真空泵[鞏義市予華儀器有限責任公司，型號：SHZ-D（Ⅲ）]；超聲波清洗器（上海科尋超聲儀器有限公司，型號：SK3300H）；超純水機（長沙市科臨電子科技有限公司，型號：EKup-Ⅱ-20T）。

2.2 主要試劑與試藥

乙腈（批號：20075279）、甲醇（批號：20075141）均為色譜純，均購于美國天地試劑公司；甲酸（上海麥克林生化科技有限公司，批號：20181201）、甲醇（太倉滬試試劑有限公司，批號：20200105）、磷酸（重慶川東化工有限公司，批號：20190629）均為分析純；怡寶純凈水（華潤怡寶飲料有限公司，批號：14310Z10J）；0.22 μm 微孔濾膜（天津津騰實驗設備有限公司，批號：160531014）。 阿魏酸、王百合苷A（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20007、B25344，純度≥98%）；龍牙百合為湖南省邵陽市隆回縣百合加工廠提供，由湖南中醫藥大學藥學院石繼連教授按2020 版《中華人民共和國藥典》有關項下進行鑒定[20]，其中S5、S8、S16、S19 批次龍牙百合浸出率不符合2020 版《中華人民共和國藥典》標準，其余均符合標準。

2.3 方法

取39 批次干燥龍牙百合按2020 版《中華人民共和國藥典》采用冷浸法測定浸出率[20]；并采用UPLC 獲得39 批次百合指紋圖譜[21]。

2.3.1 供試品制備 參考相關文獻進行百合供試品溶液制備[21]：百合粉碎后過4 號篩，取粉末0.5 g，置于50 mL 錐形瓶中，精密稱定，加入50%甲醇20 mL，稱重，記錄重量，室溫下靜置1 h，超聲提取40 min，50%甲醇補足失重，放入12 000 r/min 離心機（離心半徑93 mm）離心10 min，去上清液過0.22 μm 微孔濾膜，置于進樣小瓶中，待測。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱定王百合苷A 1.00 mg，定容到10 mL 容量瓶，分別吸取一定量配制濃度為10、20、40、80 μg/mL 標準溶液，過0.22 μm微孔濾膜后備用；精密稱定阿魏酸5.00 mg 定容到10 mL 容量瓶，分別吸取一定量配制濃度為1、10、40、75、150 μg/mL 的標準溶液，過0.22 μm 濾膜后備用。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEHC18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫：0～2 min，3% A；2～6 min，3%～10% A；6～9 min，10%～15% A；9～12 min，15% A；12～16 min，15%～25% A；16～18 min，25%～30% A；18～22 min，30%～40% A；22～25 min，40%～80% A；25～27 min，80%～95% A；27～30 min，95% A；30～36 min，3% A；柱溫35 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量3 μL。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 精密度實驗 精密取百合粉末樣品0.5 g，按照“2.3.1”項下方法制備供試品，在“2.3.3”項下的色譜條件連續進樣6 次， 測得王百合苷A 相對保留時間RSD 為0.06%，峰面積RSD 為0.21%，表明儀器的精密度良好。

3.1.2 重復性實驗 精密取鮮百合粉末6 份，每份精密稱取0.5 g，按照“2.3.1”項下方法制備供試品，在“2.3.3”項下色譜條件下進樣，計算王百合苷A 的相對峰保留時間RSD 為0.04%， 峰面積的RSD 為4.93%，表明實驗重復性良好。

3.1.3 穩定性實驗 精密稱取百合粉末0.5 g，按照“2.3.1”制備供試品，按照“2.3.3”項下的色譜條件在0、2、4、6、8、12 h 進樣，以王百合苷A 為對照峰，計算相對保留時間RSD 為0.11%，相對峰的RSD 為2.55%，表明供試品12 h 內穩定性良好。

3.1.4 加樣回收實驗 平行精密稱取已知含量（0.409 7 mg/g）的百合粉末9 份，精密稱定，按照已知量的50%、100%、150%水平精密加入王百合苷A和阿魏酸對照品，按照“2.3.1”制備供試品溶液，每個質量濃度制成3 份，按照“2.3.3”項下色譜條件進樣計算得到王百合A 的平均回收率為100.51%，RSD 值為2.60%，詳見表1，結果表明該方法準確性良好。

表1 王百合苷A 加樣回收率結果

3.1.5 線性關系考察 王百合苷A 和阿魏酸對照品溶液按“2.3.3”項下色譜條件測定樣品。 以對照品濃度（μg·mL-1）為橫坐標，相應峰面積（μA·s）為縱坐標，得到各指標成分的線性回歸方程和線性范圍。 得到王百合苷A 和阿魏酸回歸方程分別為：Y=63 247X-17 113，R=0.998 2；Y=42 957X-25 800，R=0.999 5，表明王百合苷A、阿魏酸分別在10～100，10～150 μg·mL-1與峰面積呈良好線性關系。

3.2 不同批次龍牙百合UPLC 指紋圖譜的建立

取39 批龍牙百合樣品，按“2.3.1”項下方法制備龍牙百合供試品溶液，進樣得到指紋圖譜，如S1；按“2.3.2”項下方法制備的混標溶液，標注為S2；按“2.3.3”項下色譜條件測定UPLC 圖譜，并采用國家藥典委員會2012 版中藥指紋圖譜相似度評價軟件進行圖譜處理，詳見圖1。

圖1 龍牙百合樣品及標準品的UPLC 指紋圖譜

3.3 龍牙百合指紋圖譜“印跡模板”成分簇的劃分

將39 批次龍牙百合指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，經校正、匹配后導出數據，獲得不同保留時間的匹配頻數，詳見圖2，其中高匹配頻數的成分主要集中在7.29～19.03 min，說明共有成分主要集中在這個保留時間段內；39 批次龍牙百合指紋圖譜共有峰有12 個。 按式（1）公式計算出39 批次龍牙百合成分簇劃成“印跡模板”中心成分的最少匹配頻數為40.93 個，所以取大于最大匹配頻數39 的匹配頻數色譜峰為“印跡模板”成分簇中心成分，共確定了12 個“印跡模板”成分簇；再根據式（2）劃分出每個“印跡模板”成分簇間的界線，再根據段帶統計矩法計算出新保留時間和新峰面積，其劃分后生成新的指紋圖譜的保留時間和峰面積見表2。

表2 39 批次龍牙百合浸出率及“印跡模板”成分簇劃分后的新指紋圖譜

圖2 39 批次龍牙百合不同保留時間的共有峰匹配頻數圖

3.4 譜量學方程的建立及驗證

3.4.1 譜量學方程的建立 所有數據采用Excel 收集，將數據導入SPSS 26.0 軟件，以浸出率（CT）作為因變量，12 個“印跡模板”成分簇總峰面積參數作為自變量，進行線性回歸，建立龍牙百合譜量學方程：

由于中藥化學成分受到遺傳、產地、加工炮制等因素的影響，使得其化學成分種類和含量存在動態多樣性。 然而中藥材化學成分呈現“印跡模板”穩定和隨株隨域隨法變化的規律[22]，可基于“印跡模板”成分簇構建的譜量學模型進行成分的印跡性分析。回歸系數反映一個變量對因變量的響應值，回歸系數越大，代表這個變量內的值變化更容易被檢測到，說明這個“印跡模板”成分簇的成分種類或含量較大，而回歸系數標準差可表征出“印跡模板”成分簇中化學成分的變異程度。 當回歸系數與成分簇總峰面積聯系起來時，體現出成分簇的藥效屬性大小[23]，即該成分簇的作用量大小，因此回歸系數與總峰面積（即AUCT）的乘積可表示該“印跡模板”成分簇對浸出物體系印跡量的占比，可表征出成分簇的印跡作用大小。 而回歸系數的正負代表“印跡模板”成分簇對浸出物體系中“印跡模板”成分變化的作用方向，可表征其對浸出率的貢獻，而作用量的標準差可以表征成分簇濃度變化的上下限。

對12 個“印跡模板”成分簇的回歸系數、回歸系數與總峰面積乘積和回歸系數的正負進行排序，詳見表3。 由表可知，“印跡模板”成分簇6 中的成分種類或含量變化最大，“印跡模板”成分簇12 變化最小；“印跡模板”成分簇1 在龍牙百合化學多成分體系的“印跡模板”作用最大，“印跡模板”成分簇9 作用最小；在龍牙百合化學多成分體系中，“印跡模板”成分簇2、3、4、9、11、12 可能是促進浸出物生成的“印跡模板”成分簇，而“印跡模板”成分簇1、5、6、7、8、10 可能是減少浸出物生成的成分簇，兩者相互作用，達到平衡時的浸出率為24.40%，而RSD 為21.72%，超出了一般中藥制劑質量允許變化的10%范圍。

表3 12 個“印跡模板”成分簇的貢獻率、回歸系數、作用量及標準差排序表

3.4.2 實驗驗證 王百合苷A 和阿魏酸在多批次百合藥材中都存在[24]，王百合苷A 按保留時間劃分歸屬于“印跡模板”成分簇3，阿魏酸則歸屬于“印跡模板”成分簇7，對二者進行含量測定。 39 批次龍牙百合中王百合苷A 和阿魏酸含量見表4。 王百合苷A 的含量在0.277～1.805 mg/g 范圍之內，RSD 值為44.23%，說明“印跡模板”成分簇3 中成分含量變化較大；阿魏酸含量在0.094～0.331 mg/g 之間，RSD 值為30.93%，較之王百合苷A 變化少；結果表明“印跡模板”成分簇3 中成分含量比“印跡模板”成分簇7大，變化趨勢初步驗證上述結果。

表4 39 批次龍牙百合中王百合苷A 和阿魏酸含量測定結果

另取上述龍牙百合樣品（n=3），按“2.3.1”制備處理得供試液，進樣后獲得指紋圖譜并劃分“印跡模板”成分簇，將各“印跡模板”成分簇的總峰面積代入譜量學方程，回歸方程得CT分別為22.74%、22.78%、31.84%，平均偏差為8.98%，兩組數據相關系數為0.983，并在質量控制10%以內。驗證結果說明建立的譜量學方程能較好地預測不同批次龍牙百合的浸出率。

4 討論

綜上，當中藥用量確定、藥材的產地確定、色譜的條件固定時，各“印跡模板”成分簇的響應系數、保留時間、印跡性及成分構成比是穩定的，AUCT、MCRTT 為一定值[22]，呈現“三穩三不穩”變化規律；用不同“印跡模板”成分簇總峰面積對浸出率進行多元線性回歸可建立譜量學模型，并對成分進行定量分析：首先獲得中藥或中藥復方的指紋圖譜，再運用匹配頻數法劃分“印跡模板”成分簇[25]，根據朗伯-比爾定律將其總峰面積與浸出率關聯可建立譜量學模型。 通過分析譜量學模型參數即可確定質量控制的成分簇種類；并根據回歸系數的可信區間范圍確定各成分簇濃度的變化范圍；此外還能將常數項的貢獻程度作為預測浸出率平均值的參考。 本文基于超分子“印跡模板”理論建立了龍牙百合的譜量學方程，可用于龍牙百合的總浸出物的定量分析，為龍牙百合及其制劑制備生產中質量評價方法提供了新的思路。 后續還需要更進一步的實驗驗證，包括不同時期中藥化學成分變化規律的檢測、“印跡模板”成分簇的分離以及藥效驗證。