天名精總倍半萜內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

姚思凡，陳迪路，張 藝，周小江，2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

天名精（Carpesium abrotanoides L）為菊科天名精屬草本植物，又稱鶴虱草、活鹿草、天門(mén)精、玉門(mén)精等。廣泛生長(zhǎng)于路邊、溪邊和山坡，分布于我國(guó)西南、華中、華南等地區(qū)[1]。 天名精始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。其性辛涼，味苦，有小毒，具有驅(qū)蟲(chóng)的功效[2-3]，《本草綱目·草部》曾記載：“久服身輕耐老”[4]?，F(xiàn)收錄于2009 版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，用于治療咽喉腫痛，蛔蟲(chóng)病、蟯蟲(chóng)病等蟲(chóng)積腹痛，在苗族、土家族等少數(shù)民族被廣泛應(yīng)用[5]。

在前期藥效學(xué)和毒理學(xué)試驗(yàn)中，本課題組證明了天名精總倍半萜內(nèi)酯提取物具有較好的抗癌和抗流感病毒作用，同時(shí)毒副作用小[6]。研究表明，天名精總倍半萜內(nèi)酯具有抗甲型H1N1 流感病毒的藥理作用，其中11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮為其主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒等廣泛的藥理活性[7-10]。 但是目前尚無(wú)關(guān)于天名精總倍半萜內(nèi)酯相關(guān)成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究的報(bào)道。 本文對(duì)天名精總倍半萜內(nèi)酯進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，以期解釋3 種天名精總倍半萜內(nèi)酯在動(dòng)物體內(nèi)的代謝規(guī)律，進(jìn)一步為天名精總倍半萜內(nèi)酯提取物抗甲型H1N1 流感病毒藥物的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器與試劑

LC-16 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；As3120型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；CP214 型分析天平（美國(guó)奧豪斯公司）；SorvaLL ST 8R 型高速離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司）；HSC-24A型氮?dú)獯蹈蓛x（天津恒奧科技有限公司）；QL-866 型渦旋振蕩器（海門(mén)市其林貝爾公司）。 怡寶水（華潤(rùn)集團(tuán)，批號(hào)：60220010265)；乙腈（色譜純，批號(hào)：20145210）、甲醇（色譜純，批號(hào)：32157560）均購(gòu)自美國(guó)天地公司；乙酸乙酯（分析純，國(guó)藥集團(tuán)，批號(hào)：20191013）。

1.2 試藥

供試品：天名精總倍半萜內(nèi)酯，自制。對(duì)照品：11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯和天名精內(nèi)酯酮均為自制，經(jīng)1D-和2D-NMR 分析，同時(shí)參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11-14]確定結(jié)構(gòu)，并經(jīng)HPLC 峰面積歸一化法檢測(cè)，純度均大于97%。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性SD 大鼠（270±10） g。 購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)[許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-005]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：WondaSiL C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水（29.5∶70.5）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：211 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。 在該色譜條件下，11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮的色譜峰理論塔板數(shù)均大于4000，各個(gè)色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，符合要求。

2.2 母液配置

精密稱取干燥至恒重的11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯和天名精內(nèi)酯酮適量，分別置于25 mL 容量瓶中，加入甲醇，分別配置成濃度為44、40、40 μg/mL的對(duì)照品溶液。 置于4 ℃冰箱中避光保存，備用。

2.3 血漿樣品處理

精密移取血漿100 μL，置于1.5 mL EP 管中，加入500 μL 乙酸乙酯，渦旋混勻3 min，在4 ℃、10 000 r/min 條件下高速離心10 min（離心半徑6 cm），取上清液于1.5 mL EP 管中，重復(fù)萃取2 次，合并2次的乙酸乙酯萃取液，加入4 倍量乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻30 s，于40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)尤?00 μL 流動(dòng)相渦旋振蕩溶解，在4 ℃，10 000 r/min條件下高速離心10 min（離心半徑6 cm），取上清液20 μL 進(jìn)樣。

2.4 方法學(xué)考察[15-17]

2.4.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別移取100 μL 空白血漿、加入25%羥丙基-β-環(huán)糊精的100 μL 陰性對(duì)照、加入天名精總倍半萜內(nèi)酯提取物的100 μL 空白血漿、100 μL 給藥后大鼠血漿，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)和25%羥丙基-β-環(huán)糊精不干擾天名精總倍半萜內(nèi)酯中3 種主成分的測(cè)定，且3 種主成分的色譜峰峰型良好。 保留時(shí)間分別為43.3、46.5、50.8 min，詳見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取“2.2”項(xiàng)下配制的11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮各8 mL，溶于25 mL 容量瓶中，加甲醇適量定容，得到3 種主成分的混標(biāo)母液，混勻備用。移取混標(biāo)母液，配置成系列濃度的混合對(duì)照品溶液。 取各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各20 μL，加入100 μL 空白血漿，配制成相應(yīng)的系列質(zhì)量濃度含藥血漿樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理樣品，再以各主成分相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得各成分的回歸方程：11(13)-二氫特勒內(nèi)酯為Y=25 909X-527.53，R2=0.993；特勒內(nèi)酯為Y=29 787X+493.56，R2=0.995；天名精內(nèi)酯酮為Y=28 107X-2026，R2=0.991。 詳見(jiàn)圖2。

圖2 3 種天名精總倍半萜內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明，在此色譜條件下，特勒內(nèi)酯、11（13）-二氫特勒內(nèi)酯在濃度為0.031～12.8 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。 天名精內(nèi)酯酮在濃度為0.034～14.1 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取混標(biāo)母液及大鼠空白血漿100 μL，分別配制低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿對(duì)照品溶液：11(13)-二氫特勒內(nèi)酯(0.64、0.64、0.70 μg/mL)、特勒內(nèi)酯(1.60、1.60、1.76 μg/mL)、天名精內(nèi)酯酮(6.40、6.40、7.04 μg/mL)，每個(gè)濃度平行配制5 份。將血漿按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，取上清液進(jìn)行色譜分析，測(cè)定血漿中3 種天名精總倍半萜內(nèi)酯成分。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算質(zhì)量濃度，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d 重復(fù)上述操作，計(jì)算日間精密度。 詳見(jiàn)表1。

結(jié)果顯示，上述方法測(cè)得的日內(nèi)RSD、日間RSD和相對(duì)回收率均小于15%，符合生物分析方法指導(dǎo)原則的要求。

2.4.4 回收率實(shí)驗(yàn) 取大鼠空白血漿加入混標(biāo)母液，分別配制低、中、高3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度平行配制5 份。 按照“2.3”項(xiàng)下的方法處理血漿樣品后檢測(cè)，記錄目標(biāo)峰的峰面積為血漿標(biāo)準(zhǔn)峰面積。 另取3 支EP 管，每組取一支加入與配制血漿對(duì)照品溶液相同的對(duì)照品溶液，40 °C 氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶，取20 μL上清液進(jìn)液相檢測(cè)；記錄低、中、高3 種不同濃度下目標(biāo)化合物的峰面積為對(duì)照品的峰面積。 計(jì)算血漿中樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積比值，即為絕對(duì)回收率。詳見(jiàn)表1。

表1 精密度和回收率考察結(jié)果

結(jié)果顯示，RSD 均小于15%，符合生物樣品定量分析方法指導(dǎo)原則的要求。

2.4.5 樣品穩(wěn)定性測(cè)定 分別配制低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行配制5 份。取低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品按“2.3”項(xiàng)下方法處理，取0、12、24、48 h 的樣品上清液注入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析，測(cè)定血漿中目標(biāo)化合物的峰面積，考察室溫條件下放置48 h 血漿樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示低、中、高3 個(gè)質(zhì)量濃度的血漿樣品中，11(13)-二氫特勒內(nèi)酯RSD 分別為6.02%、3.15%、5.20%；特勒內(nèi)酯RSD 分別為4.05%、1.61%、5.76%；天名精內(nèi)酯酮RSD 分別為4.59%、3.54%、5.73%。

取低、中、高3 種不同濃度的血漿質(zhì)控樣品，反復(fù)凍融3 個(gè)循環(huán)，測(cè)定血漿樣品從-80 ℃至室溫條件下凍融3 個(gè)循環(huán)的穩(wěn)定性。 低、中、高3 個(gè)不同濃度血漿質(zhì)控樣品中11(13)-二氫特勒內(nèi)酯的RSD 分別為3.46%、4.38%、5.76%；特勒內(nèi)酯的RSD 分別為6.71%、5.81%、1.78%；天名精內(nèi)酯酮RSD 分別為8.95%、3.18%、1.79%。

取低、中、高3 個(gè)不同濃度的血漿質(zhì)控樣品，考察樣品在-80 ℃條件下凍存7 d 的穩(wěn)定性。 3 個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品中11(13)-二氫特勒內(nèi)酯的RSD 分別為6.11%、2.55%、4.07%；特勒內(nèi)酯的RSD 分別為7.03%、7.74%、2.46%；天名精內(nèi)酯酮RSD 分別為7.71%、6.18%、1.43%。 詳見(jiàn)表2。

表2 樣品穩(wěn)定性考察

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天名精總倍半萜內(nèi)酯血漿樣品穩(wěn)定性RSD 均小于10%，說(shuō)明天名精總倍半萜內(nèi)酯血漿樣品在以上3 種情況下基本穩(wěn)定。

2.5 大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

用50 μL 乙醇溶解樣品后，以25%的羥丙基-β-環(huán)糊精為溶劑，制備質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的天名精總倍半萜內(nèi)酯藥液，超聲使其完全溶解。選取9只健康雄性SD 大鼠，通過(guò)尾靜脈注射給藥，劑量為50 mg/kg。 給藥后5、10、15、20、30、45 min 及1、1.5、2、3、4、6、8 h 通過(guò)眼底靜脈叢取血約0.5 mL，將采集的全血收集于肝素抗凝管中，以4000 r/min 的速度離心15 min（離心半徑6 cm），吸取上層血漿。 按照“2.3”項(xiàng)下方法處理大鼠血漿樣品，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物質(zhì)量濃度。 對(duì)于計(jì)算求得的血藥濃度，使用軟件DAS 2.0 進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)擬合計(jì)算，獲得天名精總倍半萜內(nèi)酯3 種主要成分給藥后藥時(shí)曲線與相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

分析主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)并結(jié)合藥時(shí)曲線可知，天名精總倍半萜內(nèi)酯3 種成分單次尾靜脈給藥后，體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程中11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯符合三室模型，天名精內(nèi)酯酮符合二室模型。 給藥后，11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮的血藥質(zhì)量濃度迅速達(dá)到最大值，分別為3.843、9.076、2.060 μg/mL；曲線下面積AUC（0～T）分別為145.564、262.401、98.086 min/(μg·mL)；藥物半衰期t1/2為15.835、62.318、41.843 min；血漿清除率CLz為0.183、0.145、0.311 L/(min·kg)，結(jié)果見(jiàn)圖3 和表3。利用DAS 2.0 軟件對(duì)測(cè)得的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行房室模型擬合。

表3 天名精總倍半萜內(nèi)酯的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖3 天名精總倍半萜內(nèi)酯的藥時(shí)曲線

3 討論

中藥藥代動(dòng)力學(xué)是借用化學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究手段，研究中藥活性成分、組分、單味中藥和復(fù)方在機(jī)體內(nèi)的過(guò)程及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以探討中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、中藥組分的相互作用、中藥配伍機(jī)制和中藥炮制機(jī)制等科學(xué)問(wèn)題[18]。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC測(cè)定大鼠尾靜脈注射天名精總倍半萜內(nèi)酯后的多指標(biāo)成分的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，此方法可快速、靈敏、準(zhǔn)確地同時(shí)測(cè)定11(13)-二氫特勒內(nèi)酯、特勒內(nèi)酯、天名精內(nèi)酯酮3 種成分，測(cè)定結(jié)果均符合現(xiàn)行生物分析方法的相關(guān)規(guī)定[19-20]。

在給藥前選擇溶解天名精總倍半萜內(nèi)酯方法時(shí)，因其溶解度不佳，先后對(duì)比了DMSO、乙醇、β-環(huán)糊精、吐溫80、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇等表面活性劑，在查閱文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)后選擇了用乙醇溶解樣品，加入25%羥丙基-β-環(huán)糊精作為表面活性劑，增加了天名精總倍半萜內(nèi)酯的溶解度，可用于下一步的尾靜脈注射給藥[21]。 在選擇血漿樣品預(yù)處理方法時(shí)，本實(shí)驗(yàn)先后對(duì)比了蛋白沉淀法和液液萃取法，液液萃取法所選擇的溶劑為乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮等試劑，蛋白沉淀法所選擇的溶劑為甲醇和乙腈。 通過(guò)計(jì)算提取回收率，發(fā)現(xiàn)先用乙酸乙酯萃取后用乙腈沉淀蛋白為天名精總倍半萜內(nèi)酯血漿藥代動(dòng)力學(xué)中最佳的樣品處理方法。

綜上所述，本研究建立了HPLC 測(cè)定大鼠尾靜脈注射天名精總倍半萜內(nèi)酯后的多指標(biāo)成分的藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，首次研究了天名精總倍半萜內(nèi)酯靜脈給藥后在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律，為天名精總倍半萜內(nèi)酯臨床用藥提供了相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)支持，完善了湘產(chǎn)中藥材天名精的研究，為天名精總倍半萜內(nèi)酯的抗甲型H1N1 流感病毒的中藥新藥研發(fā)提供了相關(guān)數(shù)據(jù)支持，為天名精總倍半萜內(nèi)酯的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用湘產(chǎn)中藥材天名精具有重大意義。