黃連素對(duì)腦出血大鼠腦組織免疫炎癥反應(yīng)的影響

任怡君，陳璽倩，盧 偉*

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)科，湖南 長(zhǎng)沙 400012）

腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是一種常見(jiàn)的、具有高死亡率及高致殘率的腦血管疾病[1]。ICH 造成腦組織損傷的原因包括由血腫直接引起占位和壓迫作用造成的原發(fā)性損傷，以及由于腦水腫、釋放的血液成分以及炎癥反應(yīng)等造成的繼發(fā)性損傷[2]。免疫炎癥反應(yīng)失調(diào)是ICH 后繼發(fā)神經(jīng)功能損傷的重要原因[3]。ICH 后血腫附近區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，同時(shí)外周的炎性細(xì)胞通過(guò)受損的血腦屏障浸潤(rùn)腦組織，并產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，引起腦水腫并導(dǎo)致大量腦細(xì)胞死亡[4-5]。 但這些免疫細(xì)胞對(duì)于血腫的清除也起到了至關(guān)重要的作用[5]。 小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫細(xì)胞，活化后主要分化為M1（促炎型）和M2（抗炎型）亞型[6]。 調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的M1/M2 比例可以影響免疫炎癥反應(yīng)的程度，可能改善患者的臨床結(jié)局，然而目前臨床上尚缺乏針對(duì)性藥物。

黃連素是中藥黃連中的主要有效活性成分之一。 黃連素易于透過(guò)血腦屏障，其藥理作用廣泛，具有抗菌、消炎、抗病毒、降血糖、降血脂、抗抑郁、抗腫瘤等生物學(xué)活性[7]。 在腦缺血再灌注、阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，黃連素表現(xiàn)為腦保護(hù)作用[8]。黃連素可以通過(guò)對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)起到改善神經(jīng)退行性疾病的作用[9]。但是對(duì)于ICH 后黃連素治療是否可以減輕腦組織中免疫炎癥反應(yīng)尚無(wú)具體報(bào)道。 因此，本研究通過(guò)建立ICH 大鼠模型，探究黃連素對(duì)ICH 的具體治療作用。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

體質(zhì)量為250～300 g 的SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)公司。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在湖南省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房中，飼養(yǎng)環(huán)境溫度恒定，遵循晝夜節(jié)律，每日光照時(shí)間12 h，自由攝取食物及飲用水。將48 只SD 大鼠隨機(jī)分為3 組：假手術(shù)（Sham）組，模型（ICH）組，黃連素（BBR）組。 各組大鼠分為24 h 及72 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)亞組8 只。

1.2 主要試劑和儀器

Ⅳ型膠原酶（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：V900893）；10%水合氯醛（湖南維世爾生物科技有限公司，批號(hào)：WB05007A）；黃連素（鹽酸小檗堿片）（江蘇亞邦藥業(yè)，批號(hào)：H32024537）；基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）一抗、離子鈣接頭蛋白分子1（ionizedcalciumbindingadaptor molecule-1,Iba1）一抗（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)：ab76003、ab5076）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）一抗、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）一抗、精氨酸酶-1（arginase-1, Arg-1）一抗、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）一抗（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)：17590-1-AP、21865-1-AP、16001-1-AP、18985-1-AP）。

腦立體定位儀（安徽正華生物儀器設(shè)備公司，型號(hào)：ZH-藍(lán)星B）；大鼠用顱骨鉆（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司，型號(hào)：ZS-GSZ）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-6C、DYCZ-40D）；光學(xué)顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，型號(hào)：BA410T）。

1.3 造模方法

1.3.1 ICH 大鼠模型的建立 采用Ⅳ型膠原酶法造模[10]。 按照0.004 mL/g 的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠。麻醉成功后，將大鼠固定于腦立體定位儀上。剔除頭部毛發(fā)，消毒，剪開(kāi)中線處的頭部皮膚，暴露前囟，以前囟為原點(diǎn)，以向右3 mm、向前1 mm、深5 mm 為注射點(diǎn)，顱骨鉆鉆開(kāi)顱骨，緩慢插入微量注射器到目標(biāo)注射點(diǎn)，以0.4 μL/min 的速度注入2 μL膠原酶溶液（含0.2 U Ⅳ型膠原酶），留針10 min，后將注射器取出，骨蠟封閉鉆孔，逐層縫合組織。Sham 組大鼠注入等量生理鹽水。術(shù)后大鼠送回動(dòng)物房。待大鼠麻醉復(fù)蘇后，使用Zea Longa 評(píng)分方法判斷造模是否成功。 Zea Longa 評(píng)分包含0～4 分，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重則得分越高，其中1～3 分的大鼠視為造模成功，0 分及4 分者予以剔除[11]。

1.3.2 黃連素給藥方法 ICH 大鼠模型構(gòu)建成功后，采用灌胃法對(duì)大鼠進(jìn)行黃連素干預(yù)，200 mg/kg，每日1 次，直至處死當(dāng)日。 其余組采用等量純凈水灌胃處理。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 改良Garcia 評(píng)分[11]評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損 采用0～3 分4 級(jí)評(píng)分方式，從以下6 個(gè)方面對(duì)動(dòng)物的表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分：運(yùn)動(dòng)的自主性、體態(tài)對(duì)稱性、前肢伸展運(yùn)動(dòng)、網(wǎng)壁攀爬能力、兩側(cè)軀體觸覺(jué)反應(yīng)和兩側(cè)胡須觸覺(jué)反應(yīng)。 總分最低3 分、最高18 分，分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明神經(jīng)功能缺損越輕，18 分代表無(wú)神經(jīng)功能缺損。1.4.2 Western blot 法檢測(cè)MMP-9、TNF-α 和IL-6含量 將血腫周圍新鮮腦組織勻漿，提取總蛋白并定量。 取等量裂解產(chǎn)物，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h，將膜于一抗中4 °C 孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min。 二抗37 °C 孵育2 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min，ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色，運(yùn)用ImageJ 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。

1.4.3 免疫熒光染色法標(biāo)記腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞

取腦組織切片室溫放置30 min 后洗滌、室溫孵育，加入一抗4 °C 過(guò)夜，PBS 振洗3 次，每次15 min，二抗孵育90 min，PBS 振洗3 次，每次15 min，封片。使用激光共聚焦顯微鏡觀察及拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以及繪圖。 各組計(jì)量數(shù)據(jù)以“±s”表示，采用One-way ANOVA 檢驗(yàn)比較各組間的差異，方差齊者采用LSD-t 檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett's 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICH 大鼠模型的建立

以10%水合氯醛麻醉SD 大鼠后，采用Ⅳ型膠原酶法造模。 Sham 組未見(jiàn)明顯的腦組織內(nèi)血腫形成；ICH 組大鼠尾狀核區(qū)出現(xiàn)明顯的血腫組織，提示ICH 模型構(gòu)建成功。 詳見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腦組織冠狀切面

2.2 黃連素干預(yù)對(duì)大鼠改良Garcia 評(píng)分的影響

與Sham 組相比，ICH 組大鼠在24 h 及72 h改良Garcia 評(píng)分明顯降低（P<0.05）。與ICH 組相比，BBR 組大鼠在24 h 時(shí)改良Garcia 評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在72 h 時(shí)改良Garcia 評(píng)分呈回升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠改良Garcia 評(píng)分（±s，n=8，分）

注：與Sham 組比較，*P<0.05。

時(shí)間點(diǎn)24 h 72 h Sham 組17.50±0.58 17.25±0.50 ICH 組11.25±1.50*9.25±1.71*BBR 組11.25±0.50 10.25±0.96

2.3 黃連素干預(yù)后ICH 大鼠血腫周圍腦組織中炎癥因子表達(dá)情況

與同時(shí)間點(diǎn)Sham 組相比，ICH 組大鼠腦組織中MMP-9、TNF-α、IL-6 表達(dá)均明顯增加（P<0.05）。24 h 時(shí)，與ICH 組相比，BBR 組大鼠腦組織中MMP-9 表達(dá)明顯降低（P<0.05），TNF-α 和IL-6 表達(dá)降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 72 h 時(shí)，與ICH 組相比，BBR 組大鼠腦組織中MMP-9 和TNF-α 表達(dá)明顯降低（P<0.05），IL-6 表達(dá)降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠炎癥因子表達(dá)情況

2.4 黃連素干預(yù)后ICH 大鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞極化情況

24 h 及72 h 時(shí)，Sham 組大鼠腦組織中Iba1、i-NOS、Arg-1 熒光信號(hào)弱，小膠質(zhì)細(xì)胞基本未活化。與Sham 組相比，24 h 及72 h ICH 組大鼠腦組織中Iba1、iNOS、Arg-1 熒光信號(hào)增強(qiáng)；與24 h ICH組相比，72 h ICH 組大鼠腦組織中Arg-1 熒光信號(hào)更強(qiáng)。與ICH 組相比，24 h 及72 h BBR 組iNOS 熒光信號(hào)減弱，Arg-1 熒光信號(hào)增強(qiáng)，且Arg-1 與Iba-1雙陽(yáng)性的細(xì)胞（M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞）比例升高。 詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物免疫熒光染色圖（×400）

3 討論

ICH 是第二大卒中類型，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高的特點(diǎn)，已經(jīng)成為全球危及健康的主要問(wèn)題之一[1，12]。 ICH 后繼發(fā)性腦損傷是引起神經(jīng)功能缺損的主要原因之一，包括腦水腫形成、凝血酶釋放、細(xì)胞凋亡、血腦屏障破壞和免疫炎癥反應(yīng)等[5]，其中免疫炎癥反應(yīng)又是引起繼發(fā)性腦損傷的重要因素。 ICH 后大量血漿蛋白和細(xì)胞因子等物質(zhì)被釋放到組織間隙中，繼而激活補(bǔ)體、免疫系統(tǒng)[13]，引起局部和全身炎癥反應(yīng)，造成腦組織損傷以及炎癥水腫，但是免疫炎癥反應(yīng)同時(shí)也參與了血腫清除等修復(fù)過(guò)程[5]。 因此，調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)可能有助于清除血腫、減輕腦水腫，從而改善ICH 造成的神經(jīng)功能障礙[14-15]。 然而，目前臨床上ICH 繼發(fā)性損傷的治療效果不甚理想，特別是缺乏有效調(diào)節(jié)ICH 后免疫炎癥反應(yīng)的藥物，因此，尋找一個(gè)理想的治療藥物對(duì)改善ICH 患者臨床預(yù)后具有重要意義。

黃連素是傳統(tǒng)中草藥黃連中的有效生物活性成分之一，曾經(jīng)是治療消化道感染的一線藥物，目前隨著各項(xiàng)研究的開(kāi)展，發(fā)現(xiàn)其在高血糖、高脂血癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病中均可以發(fā)揮藥理作用[7]。 研究發(fā)現(xiàn)，黃連素具有抗炎、抗菌、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫等多種生物活性[8，16-17]。 但目前黃連素在ICH中的作用研究甚少。有研究發(fā)現(xiàn)，口服黃連素可以抑制線粒體凋亡通路，從而改善ICH 大鼠的神經(jīng)功能缺損[18]，提示黃連素可能有助于ICH 的治療，但是黃連素是否可以在ICH 后調(diào)節(jié)腦組織免疫炎癥反應(yīng)尚不清楚。 基于黃連素在既往其他疾病研究中的免疫調(diào)節(jié)作用，本研究在ICH 大鼠模型中探索黃連素是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)ICH 后免疫炎癥反應(yīng)來(lái)減輕神經(jīng)功能缺損，從而改善預(yù)后。

本研究結(jié)果顯示，使用黃連素干預(yù)后，ICH 大鼠腦組織中的促炎因子MMP-9、TNF-α、IL-6 表達(dá)出現(xiàn)不同程度的下降，因此認(rèn)為黃連素可能通過(guò)緩解ICH 大鼠腦組織中的免疫炎癥反應(yīng)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

此外，對(duì)大鼠腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化和極化的研究顯示，經(jīng)黃連素干預(yù)的ICH 大鼠腦組織中出現(xiàn)M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞比例降低、M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞比例升高，且在72 h 時(shí)這種小膠質(zhì)細(xì)胞亞型極化的改變趨勢(shì)更為顯著。 既往文獻(xiàn)表明，M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞為促炎亞型，可造成組織損傷加重，而M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞為抗炎亞型，發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用[19]，小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型極化比例增加可以減輕炎性損傷。 而在黃連素干預(yù)24 h 后大鼠神經(jīng)功能缺損無(wú)改善，72 h 后的大鼠神經(jīng)功能缺損呈現(xiàn)改善趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測(cè)可能與黃連素干預(yù)后觀察時(shí)間點(diǎn)較短，或與樣本量較少有關(guān)，下一步實(shí)驗(yàn)將適當(dāng)延長(zhǎng)觀察時(shí)間以及增加實(shí)驗(yàn)樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。因此，黃連素可能通過(guò)下調(diào)炎癥因子表達(dá)、促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M2 抗炎亞型，從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)，表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。

黃連素作為傳統(tǒng)中藥成分，提取自天然植物中，價(jià)格低廉、口服副作用小。 雖然黃連素經(jīng)胃腸道吸收效果有限，但目前通過(guò)納米技術(shù)、微分子等藥物新形式提高藥物利用度的研究方向是一大熱點(diǎn)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)黃連素具有緩解ICH 后腦組織中免疫炎癥反應(yīng)的作用，為臨床上使用黃連素藥物作為ICH 輔助治療方案提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 在未來(lái)，黃連素在ICH 中的具體神經(jīng)保護(hù)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，這對(duì)于挖掘和發(fā)展中醫(yī)藥醫(yī)學(xué)具有十分重要的意義。