基于OPG/RANK/RANKL 信號通路探究益腎健骨顆粒對絕經后骨質疏松大鼠BMSCs 成骨分化的影響

劉 勇，易振宇，張信成

（1.湖南省中西醫結合醫院醫保科，湖南 長沙 410006；2.湖南省中西醫結合醫院脊柱骨腫瘤科，湖南 長沙 410006；3.湖南省中西醫結合醫院創傷關節科，湖南 長沙 410006）

骨質疏松癥主要表現為骨量減少、骨微結構破壞，可增加骨折風險，多發于老年人，在絕經后的女性中發病率高達50%，雌激素替代療法為治療骨質疏松癥的有效措施，但是長期使用可增加乳腺癌的風險[1-2]。 益腎健骨顆粒具有補益肝腎、益氣養血、化瘀通絡的作用，對芳香化酶抑制劑相關的肌肉骨骼癥狀具有良好的改善作用[3]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）可分化為成骨細胞，在維持骨的重建過程中發揮重要作用[4]。 研究顯示，健骨顆粒可以調低miR-141 的表達，促進BMSCs 成骨分化[5]。 骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/核因子κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor-kappa B, RANK）/RANK 配體（RANK ligand, RANKL）信號通路在骨吸收與骨形成過程中發揮調控作用，激活OPG/RANKL/RANK 信號通路可抑制破骨細胞的分化和成熟，促進BMSCs細胞成骨分化[6]。 因此，本研究探索腎健骨顆粒對絕經后骨質疏松大鼠BMSCs 成骨分化及OPG/RANK/RANKL 信號通路的影響，以期闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級SD 雌性未受孕大鼠（7～8 周齡），體質量（200±20） g，購自廣州中醫藥大學[生產許可證號：SCXK（粵）2019-0047]。

1.2 主要材料

益腎健骨顆粒（批號：20210320，湖南省中醫藥研究院制劑室）；β-磷酸甘油鈉（批號：G9422）、地塞米松磷酸鈉注射液（批號：D1576）、茜素紅S（批號：A5533）均購自美國Sigma 公司；OPG 小干擾RNA（small interfering RNA-OPG, si-OPG，批號：Z190301）、小干擾RNA 陰性對照（small interfering RNA negative control, si-NC，批號：A20210324）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP，批號：202104085）、Runt 相關轉錄因子2（Runt-associated transcription factor 2,Runx2，批號：202006011）、骨鈣素（osteocalcin, OCN，批號：H20210816）引物均購自廣州銳博生物科技有限公司；反轉錄第一鏈cDNA 合成試劑盒（批號：K1622，美國Thermo Fisher 公司）；通用型熒光定量試劑盒（批號：04913914001，美國Roche 公司）；5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, BCIP）/四唑硝基藍（nitro blue tetrazolium chloride monohydrate, NBT）堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（批號：C3206）及ALP 活性試劑盒（批號：P0321M）均購自碧云天生物科技有限公司；OPG（sc-390518）、RANK（批號：sc-59981）、RANKL（批號：sc-52950）抗體均購自美國Santa cruz 公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）熒光標記抗體CD29-FITC（批號：ab21845）、藻紅蛋白（phycoerythrin,PE）標記的CD44-PE（批號：ab23396）、CD45-FITC（批號：ab33916）和CD34-PE（批號：ab223930）抗體均購自美國Abcam 公司。 凝膠成像系統（型號：FluorChem HD2， 美國自然基因科技有限公司）；流式細胞儀（型號：CytoFLEX， 美國貝克曼庫爾特公司）；相差顯微鏡（型號：CX23，日本奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 含藥血清制備 給予大鼠益腎健骨顆粒灌胃，根據大鼠與人藥物計量換算關系，大鼠每日用量為140 mg，溶解于0.5 mL 生理鹽水。 另取大鼠給予不含藥的生理鹽水0.5 mL 灌胃。 所有大鼠均給藥1周，給藥結束后，腹主動脈采全血后，1500 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min 取上清液并過濾除菌，分別獲得益腎健骨顆粒含藥血清及正常血清，置于-20 ℃冰箱冷凍備用。

1.3.2 BMSCs 細胞分離與鑒定 參照文獻[7]中的方法，采用背側雙切口切除雙側卵巢建立絕經后骨質疏松模型，術后1 d 開始各組每日注射青霉素（2.0×105 IU/kg），共3 d。造模12 周后，用microCT 股骨遠端掃描及檢測體質量，當骨密度，骨體積分數、骨小梁數量等數值較正常顯著降低時，提示造模成功[8]。

造模成功后斷頸處死大鼠，無菌條件分離股骨和脛骨，去兩端骨骺暴露骨髓腔，使用注射器注射α-MEM 培養基反復吹打骨髓腔，收集細胞并過濾，接種至培養瓶中常規傳代培養，每隔3 d 換液，取第3 代BMSCs 用于后續實驗，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。

流式細胞術鑒定BMSCs 表面標志物：收集細胞液，1000 r/min，離心半徑10 cm，離心5 min 收集細胞沉淀，PBS 洗滌并重懸，加入CD29-FITC、CD44-FITC、CD45-PE-Cy5.5 和CD34-PE 抗體，避光孵育，流式細胞儀檢測。

1.3.3 BMSCs 細胞分組及成骨分化誘導 第3 代BMSCs 制備成1×104/mL 的細胞懸液，接種于6 孔板中，將細胞分為對照組（N 組）、含藥血清組（J 組）、含藥血清+si-NC 組（J+C 組）、含藥血清+si-OPG 組（J+O 組），每組6 個復孔。J+C 組、J+O 組細胞分別轉染si-NC、si-OPG 質粒。 轉染48 h 后，N 組培養液加入正常血清，其余組培養液中均加入益腎健骨顆粒含藥血清。 待細胞融合至約90%時，進行成骨分化誘導培養，使用α-MEM 培養基（含有10% FBS、10 μmol/Lβ-磷酸甘油、10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L維生素C）進行誘導培養，每隔3 d 換成骨分化誘導培養基。

1.3.4 ALP 染色 成骨分化誘導7 d 后，棄去培養液，于4%多聚甲醛中固定15 min，加入BCIP/NBT堿性磷酸酯酶染色液，避光染色30 min，觀察染色情況。 另收集細胞，使用ALP 檢測試劑盒檢測ALP活性。

1.3.5 茜素紅S 染色 BMSCs 成骨誘導28 d 后，棄去培養液加入4%多聚甲醛固定30 min， 加入0.2%茜素紅S 染色液染色30 min，蒸餾水沖洗多余液體，待細胞干燥后，倒置相差顯微鏡觀察并拍照，隨機選取5 個視野，計算礦化結節數。

1.3.6 RT-qPCR 實驗檢測ALP、Runx2、OCN mRNA表達 收集各組BMSCs 細胞，加入Trizol 試劑提取中總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，PCR 擴增檢測ALP、Runx2、OCN mRNA 相對表達量。 ALP 正向引物為TGGTACTCGGACAATGAGATGC，反向引物為GCTCTTCCAAATGCTGATGAGGT；Runx2 正向引物為CCTCTGACTTCTGCCTCTGG，反向引物為GATGAAATGCTGGGAACTG；OCN 正向引物為GGGCTCCAAGTCCATTGTT，反向引物為ACCCGAATGTTGAGCGAGAG。 以β-ation 為內參，采用2-△△Ct法計算各基因相對表達量。

1.3.7 Western blot 檢測OPG、RANK、RANKL 蛋白表達 BMSCs 成骨誘導培養7 d 后，離心收集各組細胞加入RIPA 裂解液裂解細胞，離心收集上清液，BCA 法檢測蛋白濃度，取40 μg 蛋白加上樣緩沖液煮沸變性后，進行SDS-PAGE 分離蛋白并轉膜，分別加入稀釋后的OPG、RANK、RANKL 抗體和βactin 抗體，4 ℃搖床過夜，加入相應二抗37 ℃孵育1 h，加入增強ECL 化學發光液顯色，FluorChem HD2 凝膠成像系統成像，以β-actin 為內參，Image J軟件分析蛋白表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 進行統計分析。 計量資料符合正態分布及方差齊檢驗，用“±s”描述，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs 形態觀察、鑒定

成功分離BMSCs 細胞，大鼠第1 代細胞培養24 h后，貼壁細胞形態不一，呈現長梭形，培養至第3 代細胞時，細胞鋪滿瓶底呈梭形，且形態均一，排列緊密呈放射狀或旋渦狀。 詳見圖1。

圖1 顯微鏡下觀察BMSCs 形態

流式細胞術檢測BMSCs 細胞顯示：CD29（97.34%）、CD44（98.35%）呈陽性表達，CD45（1.85%）、CD34（2.34%）呈陰性表達。 詳見圖2。

圖2 BMSCs 的流式細胞儀分析

2.2 益腎健骨顆粒對BMSCs ALP 的影響

成骨分化誘導7 d 后，ALP 染色陽性為藍黑色。 與N 組比較，J 組與J+C 組染色加深，ALP 活性明顯升高（P＜0.05）。 與J 組、J+C 組比較，J+O 組ALP染色變淺，ALP 活性明顯降低（P＜0.05）。 詳見表1、圖3。

圖3 各組BMSCs 的ALP 染色（×200）

表1 益腎健骨顆粒對BMSCs ALP 活性的影響（±s，n=6）

表1 益腎健骨顆粒對BMSCs ALP 活性的影響（±s，n=6）

注：與N 組相比，*P＜0.05；與J+C 組相比，#P＜0.05；與J 組相比，&P＜0.05。

組別N 組J 組J+C 組J+O 組ALP/（U·L-1）278.26±21.64 426.51±30.29*435.62±28.46*383.47±24.32#&

2.3 益腎健骨顆粒對BMSCs 成骨分化礦化結節的影響

誘導成骨分化28 d 行茜素紅染色，礦化結節被染成紅色。 J 組、J+C 組較N 組礦化結節數顯著增加（P＜0.05），J+O 組較J 組、J+C 組礦化結節數顯著減少（P＜0.05）。 詳見圖4、表2。

圖4 各組BMSCs 成骨分化的茜素紅染色（×200）

表2 益腎健骨顆粒對BMSCs 成骨分化礦化結節的影響（±s，n=6）

表2 益腎健骨顆粒對BMSCs 成骨分化礦化結節的影響（±s，n=6）

注：與N 組相比，*P＜0.05；與J+C 組相比，#P＜0.05；與J 組相比，&P＜0.05。

組別N 組J 組J+C 組J+O 組礦化結節數/個6.53±1.13 15.43±2.76*14.90±2.95*9.53±1.78#&

2.4 益腎健骨顆粒對BMSCs 成骨分化相關基因mRNA 表達的影響

與N 組比較，J 組與J+C 組ALP、Runx2、OCN mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05）。 與J 組、J+C 組比較，J+O 組ALP、Runx2、OCN mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）。 詳見表3。

表3 益腎健骨顆粒對BMSCs 細胞成骨分化相關基因表達的影響（±s，n=6）

表3 益腎健骨顆粒對BMSCs 細胞成骨分化相關基因表達的影響（±s，n=6）

注：與N 組相比，*P＜0.05；與J+C 組相比，#P＜0.05；與J 組相比，&P＜0.05。

組別N 組J 組J+C 組J+O 組ALP 1.05±0.06 1.67±0.10*1.63±0.09*1.26±0.07#Runx2 1.03±0.07 1.52±0.14*1.53±0.15*1.39±0.10#OCN 0.93±0.08 1.45±0.11*1.50±0.12*1.32±0.09#&

2.5 益腎健骨顆粒對BMSCs 蛋白OPG、RANK、RANKL 表達的影響

與N 組比較，J 組與J+C 組OPG 表達水平顯著升高（P＜0.05），RANK、RANKL 表達水平顯著降低（P＜0.05）。 與J 組、J+C 組比較，J+O 組OPG 表達水平顯著降低（P＜0.05），RANK、RANKL 表達水平顯著升高（P＜0.05）。 詳見圖5、表4。

圖5 Western blot 檢測各組BMSCs 蛋白OPG、RANK、RANKL 表達

表4 各組細胞OPG、RANK、RANKL 蛋白表達比較（±s，n=6）

表4 各組細胞OPG、RANK、RANKL 蛋白表達比較（±s，n=6）

注：與N 組相比，*P＜0.05；與J+C 組相比，#P＜0.05；與J 組相比，&P＜0.05。

組別N 組J 組J+C 組J+O 組OPG 0.62±0.08 1.01±0.11*1.03±0.12*0.56±0.09#RANK 0.97±0.11 0.63±0.07*0.65±0.08*0.83±0.06#RANKL 1.05±0.12 0.51±0.07*0.53±0.06*0.75±0.08#&

3 討論

BMSCs 在一定的條件下可向軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞等分化，BMSCs 在成骨誘導條件下，向成骨細胞分化，促進BMSCs 成骨分化是治療與預防骨質疏松癥的有效策略[9-10]。 目前， 促進BMSCs 成骨分化的報道有很多，中藥提取物如補骨脂素可誘導BMSCs 成骨分化[11]。 另有研究顯示，固本增骨方（炙黃芪、當歸、燙狗脊）含藥血清可促進BMSCs 的增殖，并誘導其成骨分化[12]。中醫學認為骨質疏松癥是脾虛、腎虧等引起的，益腎健骨顆粒主要由千年健、紅花、砂仁、熟地黃等構成，方中千年健有強筋止痛功效，紅花、丹參具有益氣活血的作用，淫羊藿有活血補腎的作用，熟地黃可以強筋健骨，諸藥合用可以強筋健骨、補腎健脾之功效[13-14]。 本研究建立絕經后骨質疏松大鼠模型，經前期研究，灌胃給藥益腎健骨顆粒可改善大鼠的骨質疏松癥，但其具體作用機制尚不清楚。

本研究建立絕經后骨質疏松大鼠模型，成功分離大鼠的BMSCs 細胞，經觀察細胞形態與鑒定細胞表面標志物，與相關報道[15]一致。 本研究BMSCs 細胞使用益腎健骨顆粒含藥血清培養后，經成骨分化誘導培養7 d 后，ALP 染色加深，ALP 活性明顯升高（P<0.05），誘導成骨分化28 d 行茜素紅染色顯示礦化結節數顯著升高（P<0.05），提示益腎健骨顆粒可能具有促進BMSCs 細胞成骨分化的作用。 Runx2是成骨過程中最重要的轉錄因子，調控間充質干細胞向成骨細胞分化；OCN 為鈣結合蛋白，參與骨鈣代謝，可反映骨形成[16-17]。本研究RT-qPCR 檢測ALP、Runx2、OCN mRNA 表達顯示，J 組ALP、Runx2、OCN mRNA表達水平顯著升高（P<0.05），證實益腎健骨顆粒有促進BMSCs 細胞成骨分化的作用。

OPG/RANK/RANKL 信號通路在參與骨代謝、免疫調節、腫瘤發生方面發揮重要調控作用，該通路可誘導破骨細胞分化成熟、促進骨吸收，而上調OPG 水平可降低RANKL 與RANK 的相互作用，降低骨吸收，促進成骨分化[18-19]。 激活OPG/RANKL/RANK信號通路可抑制破骨細胞的分化和成熟，促進BMSCs向成骨分化[20]。 本研究結果顯示，經益腎健骨顆粒含藥血清的大鼠BMSCs 細胞中OPG 表達水平顯著升高（P<0.05），RANK、RANKL 表達水平顯著降低（P<0.05），提示益腎健骨顆粒可調節OPG/RANK/RANKL信號通路。本研究結果也顯示，與只經益腎健骨顆粒含藥血清處理的BMSCs 細胞相比， 先轉染抑制OPG 表達、 再用含藥血清處理的BMSCs 細胞的OPG 表達水平顯著降低，RANK、RANKL 表達水平顯著升高，且ALP 活性及礦化結節數降低，即抑制OPG 表達可部分逆轉益腎健骨顆粒對BMSCs 細胞成骨分化的促進作用。 以上結果表明，益腎健骨顆粒可通過調節OPG/RANK/RANKL 信號通路，促進絕經后骨質疏松大鼠BMSCs 成骨分化。

綜上所述，益腎健骨顆粒可通過調節OPG/RANK/RANKL 信號通路，促進絕經后骨質疏松大鼠BMSCs 成骨分化。