五甲基槲皮素改善香煙煙霧提取物誘導的急性加重慢性阻塞性肺疾病

許夏燕，李 智，潘明月，韓雨彤，易剛強，袁勁松*

（1.汕頭大學醫學院，廣東 汕頭 515041；2.深圳市羅湖區人民醫院，廣東 深圳 518000；3.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；4.北京大學深圳醫院，廣東 深圳 518000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是一種常見的可預防和可治療的疾病，以持續的呼吸道癥狀和氣流阻塞為特征，目前是全球常見的人類死亡原因之一，主要危險因素是香煙煙霧、病毒以及細菌。 目前，我國COPD 患者已經超過1 億人，成為僅次于高血壓、糖尿病的第三大常見慢性病[1-2]。 急性加重期慢性阻塞性肺病（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD） 是COPD 的呼吸道癥狀的急性惡化，是COPD 致死的重要因素。在COPD 患者中，46%的患者在前一年至少有一次病情加重，19%的患者需要住院治療[3]。

AECOPD 的發病與氣道炎癥加重有關，吸煙和呼吸道感染是AECOPD 發生發展的主要危險因素[4]。香煙煙霧和其他有毒物質可觸發肺組織中炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-17A）的釋放，從而招募炎癥細胞，加重肺損傷[5]。 在治療上，以減輕急性加重的病情以及預防再次急性加重的發生為目標，其中藥物治療是預防和控制AECOPD 的主要手段。 AECOPD 患者優先選用的藥物為β2 受體激動劑、抗膽堿藥，通過松弛支氣管平滑肌，以達到擴張支氣管、緩解氣流受限、改善肺功能和低氧血癥等目的[6]。 但是，長期使用糖皮質激素、抗生素、祛痰藥物等，易產生耐藥性。 所以，尋找新藥用于AECOPD的治療和預防具有重要的學術意義和臨床價值。

五甲基槲皮素（pentamethylquercetin）是多甲氧基黃酮類家族的一員，由甲基取代槲皮素結構中的5 個酚羥基組成，具有良好的減輕胰島素抵抗、抗炎、改善糖脂代謝紊亂的生物活性[7-9]，在藥物穩定性、口服吸收率和生物利用度等多方面較槲皮素更具有優勢[10-12]。 這些特性使五甲基槲皮素在預防和治療AECOPD 中具有潛在的價值，其作用及相關機制未見報道。因此，本研究旨在探討五甲基槲皮素對AECOPD 的療效及作用機制。 本研究建立了香煙煙霧提取物誘導的AECOPD 細胞模型，明確了五甲基槲皮素對AECOPD 細胞模型的影響，并評估其涉及的炎性反應和凋亡的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

BEAS-2B 細胞株（中國科學院上海分院）；DMEM高糖培養基購自美國Gibco 公司；五甲基槲皮素購買自Puruifa 公司；細胞計數試劑8（cell counting kit-8, CCK8）購買自MCE 公司；β-actin、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）、蛋白激酶B（proteinkinase B, AKT）、P38 蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase, P38）、應激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase 3）、活化后半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase 3）和B-細胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma-2, BCL-2）一抗購買自美國Cell signaling Technology 公司；IL-6、IL-8 檢測試劑盒購買自基因美公司。

1.2 主要儀器

雙色紅外熒光成像系統（型號：Odyssey，美國LICOR 公司）；熒光顯微鏡（型號：Axio Observer3 德國蔡司公司）；-80 ℃低溫冰箱（型號：DW-HL828中科美菱公司）；多功能電泳系統（型號：1658033，美國伯樂）；微量移液器（型號：賽默飛F3 系列）、酶標儀（型號：FC）、二氧化碳培養箱（型號：BB150）均購自美國賽默飛公司。

1.3 香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract, CSE）溶液的配制

香煙去掉濾嘴后點燃，采用50 mL 玻璃注射器收集香煙煙霧，香煙（每支含0.8 mg 尼古丁，10 mg 焦油）的煙霧導入20 mL 磷酸鹽緩沖液中，經0.22 μm過濾器進行過濾，在320 nm 處測定吸光度，建立標準曲線，并以此標準曲線對濾出液濃度進行校準，所制得的CSE 溶液分裝后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 細胞模型的建立及藥物干預

將BEAS-2B 細胞培養于完全培養基中（含10%胎牛血清，1%青/鏈霉素雙抗），靜置于5% CO2、37 ℃的細胞孵箱中培養。 待細胞融合至約50%時，更換為不含血清的高糖培養基饑餓培養12 h，之后分為4 組：對照組、1%煙霧提取物組、2%煙霧提取物組、4%煙霧提取物組，采用含不同濃度CSE 溶液（0%、1%、2%、4%，v/v）的無血清培養基繼續孵育BEAS-2B 細胞24 h，收集細胞上清液檢測IL-6 和IL-8水平并確定后續實驗CSE 建模濃度。 藥物干預實驗中，待細胞融合至約50%時即采用含不同濃度（0、1、3、10 μmol/L）五甲基槲皮素的無血清培養基預處理12 h，分為五甲基槲皮素1 μmol/L 組、五甲基槲皮素3 μmol/L 組、五甲基槲皮素10 μmol/L 組，各組分別采用含CSE 溶液的無血清培養基繼續孵育細胞24 h，收集細胞上清液和蛋白用于后續實驗。

1.5 細胞活力檢測

將BEAS-2B 細胞（2×103）接種于96 孔板中，饑餓培養12 h 后采用含不同濃度CSE 溶液或PMQ的無血清培養基繼續培養24 h。干預完成后每孔加入CCK8 試劑20 μL，繼續培養2 h 后，計算細胞活力。 使用酶標儀檢測細胞在570 nm 處的吸光度值，計算細胞活力。

1.6 IL-6、IL-8 水平檢測

將細胞上清液（50 μL/孔）加入預鋪抗體的96孔板中，按照試劑盒要求在室溫下孵育2 h 后，加入檢測抗體、鏈霉親和辣根過氧化物酶（HRP）進行反應，棄去培養基，分別加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min 后，每孔加入終止液50 μL，15 min內在450 nm 波長處檢測吸光度值。

1.7 PI3K、AKT、P38、JNK、BCL-2、Caspase 3、cleaved、Caspase 3 蛋白水平檢測

取適量細胞蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳90 min 后將產物恒壓轉移至PVDF 膜，采用5%脫脂牛奶封閉液在室溫條件下封閉1 h 后，加入目的蛋白抗體并在4 ℃冷室孵育過夜。 經TBST 溶液洗滌3 次后，加入熒光二抗在室溫暗室條件下孵育1 h，采用奧德賽紅外熒光掃描成像系統對條帶進行熒光顯影。 采用Image-Pro Plus 5.0 軟件對各條帶的灰度值進行分析。

1.8 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0 軟件處理實驗數據，計量資料以“±s”表示。 通過單因素方差分析和Newman-Keuls 檢驗對結果進行統計學分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞水平CSE 誘導AECOPD 模型的建立

與對照組相比，各濃度煙霧提取物組均可促進BEAS-2B 細胞IL-6 和IL-8 的釋放（P<0.001），因此，本研究后續實驗采用2%的CSE 溶液用于建立AECOPD 細胞模型。 詳見圖1。

圖1 香煙煙霧提取物溶液對BEAS-2B 細胞IL-6 和IL-8 釋放的影響

2.2 五甲基槲皮素可部分緩解CSE 誘導的AECOPD

0.1～10 μmol/L 五甲基槲皮素對細胞活力均無影響，后續實驗采用1、3、10 μmol/L 這3 個濃度繼續探索藥物的效果和機制。與對照組相比，五甲基槲皮素1 μmol/L 組中IL-6 的水平降低（P<0.05）；五甲基槲皮素3 μmol/L 組和五甲基槲皮素10 μmol/L 組中IL-6 和IL-8 水平降低（P<0.01，P<0.05）；其中五甲基槲皮素10 μmol/L 組對細胞中IL-8 的抑制作用強于五甲基槲皮素1 μmol/L 組（P<0.05）；五甲基槲皮素各濃度組之間對IL-6 的抑制作用無統計學意義（P>0.05）。 詳見圖2。

圖2 各組五甲基槲皮素對AECOPD 模型的影響

2.3 五甲基槲皮素可抑制CSE 誘導的細胞凋亡

與對照組相比，五甲基槲皮素1 μmol/L 組對Caspase 3、cleaved Caspase 3 表達影響無統計學意義（P>0.05），五甲基槲皮素3 μmol/L 組可抑制其蛋白表達（P<0.05），五甲基槲皮素10 μmol/L 組的抑制作用更為明顯（P<0.01，P<0.001）；同時，五甲基槲皮素3 μmol/L 組上調BCL-2 的蛋白表達（P<0.01），五甲基槲皮素10 μmol/L 組上調BCL-2 的蛋白表達并且抑制JNK 水平（P<0.01，P<0.05）。 詳見圖3。

圖3 各組五甲基槲皮素對AECOPD 模型中凋亡相關因子的影響

2.4 五甲基槲皮素可改善CSE 誘導的炎性反應

與對照組相比，五甲基槲皮素3 μmol/L 組PI3K和AKT 的表達水平降低（均為P<0.05）；五甲基槲皮素10 μmol/L 組對PI3K 和AKT 有較強的抑制作用（P<0.01），同時對P38 也有一定的抑制作用（P<0.05）。詳見圖4。

圖4 各組五甲基槲皮素對AECOPD 模型中炎性因子的影響

3 討論

氣道炎癥和黏液產生的急性加重，是導致COPD預后不良以及死亡的主要原因。 目前，COPD 的治療藥物主要以緩解癥狀為主，尋找新的療法來預防疾病進展仍具有挑戰性。 吸煙是COPD 和肺氣腫等不可逆肺疾病的主要原因，研究表明，香煙煙霧的刺激改變了機體多種機制通路，如氧化應激、代謝改變、自主神經系統功能障礙和激素改變[3]。 IL-6 和IL-8在穩定和加重的COPD 的發病機制中發揮重要作用，且IL-6 已被視為常見的AECOPD 生物標志物[13]，AECOPD 患者中IL-6 和IL-8 水平顯著高于健康對照組和穩定型COPD 患者[14-15]。在體外實驗中，CSE經常被用作香煙煙霧的替代物，雖然體外暴露于CSE 可能不能準確反映體內暴露于香煙煙霧，但報道顯示，當氣道上皮細胞暴露于揮發性香煙煙霧時，更多的IL-8 被釋放進入培養基中[16]。

本實驗成功建立了AECOPD 的細胞模型，1%、2%、4%的CSE 溶液均可明顯促進BEAS-2B 細胞IL-6 和IL-8 的釋放。 為了更有效地觀察藥物效果，選取2% CSE 溶液干預細胞。 五甲基槲皮素是天然多甲氧基黃酮類家族（polyme thoxylated flavones,PMF）的一員，是將自然界中資源含量豐富的槲皮素的結構中5 個酚羥基以甲基取代。從藥物穩定性、口服吸收率、生物利用度等多個方面與槲皮素進行比較，五甲基槲皮素更具有優勢。 前期研究表明，五甲基槲皮素可下調炎性因子IL-6、TNF-α 的表達，改善炎癥反應[17]。因此推測，五甲基槲皮素在CSE 誘導的AECOPD 細胞模型中也可能發揮其藥效作用。在前期實驗中，發現在CSE 溶液開始刺激細胞的同時給予五甲基槲皮素，細胞所釋放的IL-6 和IL-8并沒有發生變化，隨后采取預防給藥的方式繼續探索五甲基槲皮素的作用。 在加入預防用藥12 h 后，五甲基槲皮素可明顯抑制細胞IL-6 和IL-8的釋放，這一結果確定了在CSE 刺激下五甲基槲皮素對BEAS-2B 細胞的保護作用。

Caspase 3 和BCL-2 在細胞凋亡中扮演了重要的角色，本實驗中發現，五甲基槲皮素可以抑制模型細胞中Caspase 3 的表達，同時增加BCL-2 的表達。此外，另有研究報道JNK 的激活可通過從BCL-2-Beclin1 復合物中釋放Beclin1 來促進自噬[18-19]，本研究也發現了高劑量的五甲基槲皮素對JNK 也有一定的抑制作用。 這些結果說明，五甲基槲皮素有減輕BEAS-2B 細胞凋亡的潛在藥理作用。

PI3K/AKT 信號通路可通過調控炎性介質釋放等途徑對氣道炎性疾病產生影響，在COPD 的發生發展中扮演了重要的角色。如圖4 所示，五甲基槲皮素可以劑量依賴性地抑制PI3K、AKT 表達。 另有文獻報道，當氣道上皮細胞暴露于揮發性香煙煙霧時，IL-8 也可通過P38 釋放進入培養基中[16]，本實驗研究發現高劑量的五甲基槲皮素也可抑制P38 的表達。 這些結果提示，五甲基槲皮素可從多種途徑改善細胞的炎性反應。

綜上所述，五甲基槲皮素可通過抑制PI3K/AKT、P38 信號通路，在CSE 誘導AECOPD 的模型中發揮抗炎作用；同時可抑制Caspase 3 并上調BCL-2，具有潛在的抗凋亡作用。 因此，五甲基槲皮素可以用于預防AECOPD 的發生和發展，具有潛在的藥用價值。