網絡藥理學、分子對接技術結合體外實驗探討益氣解毒方及其活性成分槲皮素抑制鼻咽癌增殖的機制

鄒 攀，許紅淼，伍永慧，羅 歡，藺 婷，王賢文，周芳亮，何迎春*

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙 410208；2.湖南省中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護工程技術研究中心，湖南長沙 410208；3.中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

鼻咽癌可歸屬于中醫學“失榮”等范疇，明代陳實功《外科正宗》云：“失榮者，其患多生肩之以上，初起微腫，皮色不變……愈久愈大，越潰越堅，犯此俱為不治”。 中醫學認為，鼻咽癌的發生為在體內外各種致病因素的影響下，出現氣血凝滯或痰濁結聚，以致經絡受阻，積聚而成，或痞塞日久，則積聚壅結，郁火化熱，火毒內困而成。 古今醫家常用清熱解毒、軟堅散結、益氣養陰等治法。 田道法教授團隊遵循先賢抗鼻咽癌的寶貴經驗自創益氣解毒方，以黃連、黃芪固護元氣、鼓邪外出，達到“祛邪不傷正”和“邪去正自安”的目的；以黨參補益肺氣和白花蛇舌草清熱解毒、散癌祛毒；天花粉和茯苓健脾養陰、充養其身。全方補瀉共用、氣陰雙補，共奏益氣解毒、平和抗毒之效，在臨床應用多年并取得良好療效[1-2]。 中藥復方乃復雜物質體系，藥效物質基礎和作用靶點之間存在錯綜復雜的網絡關系。 分析并揭示這一復雜網絡之間的相互關聯性，闡明復方中眾多藥效物質基礎及其作用機制，是中醫藥亟待解決的重大科研任務[3]。 為了探究益氣解毒方抗鼻咽癌的潛在作用機制，本研究通過網絡藥理學方法建立了益氣解毒方化學成分-靶點網絡，預測益氣解毒方治療鼻咽癌的作用機制，利用體外實驗驗證益氣解毒方水提物及其活性成分槲皮素抑制鼻咽癌細胞增殖的效應及潛在作用靶點和相關通路，為復方及單體抗腫瘤提供更多的證據。

1 材料

1.1 細胞株

人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2（批號：BNCC 341794）購買于北京北納創聯生物技術研究所，由中醫藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室傳代培養。

1.2 藥物與主要試劑

益氣解毒方（黃芪30 g，茯苓10 g，黨參10 g，天花粉10 g，黃連10 g，白花蛇舌草10 g，甘草6 g），購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，水提物具體制備方法參考本課題組前期研究[4]。 順鉑（批號：MKCM2435，美國Sigma 公司）；槲皮素標準品（批號：C28J11Y116820，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

恒溫水浴箱（型號：BWS-27，中國上海一恒科學儀器有限公司）；高速冷凍離心機（型號：MRZ16A022，德國Beckman Coulter 公司）；雙人單面凈化工作臺（型號：SJ-CJ-2FD， 中國蘇州凈化設備有限公司）；CO2培養箱（型號：HERAcell150i，美國賽默飛世爾公司）；電泳儀（型號：JY600C，中國北京君意東方電泳設備有限公司）；轉膜儀（型號：690BR027656，美國Bio-Rad 公司）；實時無標記細胞功能分析儀（型號：RTCA DP，美國ACEA 公司）；倒置熒光顯微鏡（型號：AE31，中國麥克奧迪實業集團有限公司）；雙色紅外熒光成像系統（型號：ODYSSEY CLx，美國Gene 公司）。

2 方法

2.1 益氣解毒方“活性成分－靶點網絡”構建及鼻咽癌作用靶點篩選

網絡藥理學數據挖掘詳細方法參照文獻進行[5-6]。 為豐富數據擴大篩選量，運用中藥系統藥理數據庫及分析平臺（TCMSP）及中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN-TCM）、GeneCards、人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM）、藥物基因組學知識庫（PharmGkb）、治療目標數據庫（TTD)、GEO 等多個數據庫檢索益氣解毒方的化學活性成分及治療鼻咽癌的作用靶點；BATMAN-TCM 中藥數據庫以Score=100，P=0.05 為檢索條件，聯合TCMSP 數據庫獲得益氣解毒方中7 味中藥（黃連、黃芪、天花粉、白花蛇舌草、茯苓、黨參、甘草）的化學成分和潛在藥物靶點，獲得的藥物活性成分、靶點導入Cytoscape 3.6.0軟件中構建“活性成分-靶點網絡”。

2.2 益氣解毒方治療鼻咽癌的PPI 網絡構建與關鍵靶點篩選

應用R 語言繪制益氣解毒方潛在藥物靶點與鼻咽癌的疾病靶點韋恩圖；將上述靶點導入STRING 網站進行蛋白質－蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）關系網絡圖構建；通過Cytoscape 軟件中的網絡拓撲分析插件CytoNCA 對PPI 網絡進行拓撲屬性分析，獲得關鍵核心靶點進行后續研究。

2.3 功能分析

應用R 語言軟件中clusterProfilerGO、cluster-ProfilerKEGG 軟件包對共同靶點進行基因本體論（Gene Ontology, GO）分析和京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析。

2.4 分子對接

通過PubChem 下載槲皮素的2D 結構，ChemOffice 軟件將其能量最小化并導出為3D 結構；通過PDB 數據庫下載核心靶蛋白受體的3D 結構，利用Pymol 軟件對蛋白受體進行去除水分子和其他小分子的處理； 然后使用Autodock Tools 4.0軟件對蛋白受體分子進行加氫等前處理， 最后通過Autodock Vina 將處理后的潛在化學活性成分與蛋白受體分子進行分子對接。 分子對接的結合能＜0 kcal·mol-1，表明蛋白受體與化合物結合穩定，結合能越低代表化合物與蛋白受體的結合活性越強，并將結合活性強的對接結果導入Pymol 軟件，繪制三維圖進行可視化展示。

2.5 CCK-8 法、RTCA 實時無標記細胞功能分析儀和CytationTM 5 細胞成像多功能檢測系統監測細胞增殖情況

CCK-8 法參考文獻[7]進行。 取對數生長期CNE-2 細胞，按5×103個/孔接種于96 孔板中，細胞貼壁后，設置對照組（溶劑處理的CNE-2 細胞）、益氣解毒方組（0.5、1.0、1.5、2.0 g·L-1）、槲皮素組（20、40、60 μmol·L-1）、陽性對照順鉑組（3.0 mg·L-1）。 每組設置6 個復孔，分別處理24、36、48 h 后，棄原培養液，并加入CCK-8 溶液100 μL/孔，繼續孵育1 h后于酶標儀測450 nm 處檢測吸光度。 實驗重復3 次。

RTCA 實時無標記細胞功能分析儀操作參考文獻[8]進行。 取RTCA 檢測專用孔板，測基線并平衡儀器后，加入細胞懸液，分組同CCK-8 法，RTCA 監測以細胞指數（cell index, CI）反映細胞增殖情況。CI=（Rn-Rb）/15， 其中Rn 為電極阻抗值，Rb 為背景阻抗基線值，監測結束后后均一化細胞指數計算藥物相對增殖率，并繪制出細胞生長曲線。 實驗重復3次。

CytationTM5 細胞成像多功能檢測系統操作可參考文獻[9]進行。 相同方法處理細胞懸液后，置于CytationTM5 細胞成像多功能檢測儀器上，間隔6 h拍照進行一次全板自動細胞數量捕獲，計算細胞數和細胞相對增殖率。 細胞相對增殖率=藥物組細胞增殖數/對照組細胞相對增殖數×100%。

2.6 Western blot 法檢測蛋白表達水平

參考文獻[10]進行。 藥物處理細胞36 h 后，將細胞加入RIPA 裂解液，經冰上裂解、離心后，獲得總蛋白提取液，采用BCA 蛋白定量試劑盒進行定量，采用SDS-PAGE 進行蛋白電泳，半干法將膜轉印到PVDF 膜上，將PVDF 膜放入含5%脫脂奶粉的TBST 封閉液中封閉1 h，加入一抗，4 ℃搖床過夜，洗膜后加入二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜后，用Odyssey CLX 雙色紅外熒光掃描成像系統分析蛋白表達。 實驗重復3 次。

2.7 統計學分析

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析，服從正態分布計量資料用“±s”表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，多重比較，方差齊性用LSD檢驗，方差不齊用Dunnet’s T3 檢驗。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 益氣解毒方有效成分篩選及ADME 分析

利用TCMSP 及BATMAN-TCM 數據庫篩選得到有效成分黃連14 個、黃芪25 個、白花蛇舌草5個、黨參42 個、茯苓12 個、天花粉14 個、甘草106個，去除重復化合物，共計197 個有效成分，獲得藥物靶點493 個，其中，部分中藥存在共同成分。 槲皮素為黃連、黃芪、白花蛇舌草和甘草共同成分，20-十六烷醇為黃芪、黨參、茯苓、天花粉的共同成分；黃芪和甘草共同含有山柰酚、芒柄花黃素、異鼠李素等。按靶點度值排名，前5 名分別是槲皮素、山柰酚、木犀草素、2-呋喃甲醛、壬二酸，度值高的活性成分有可能為益氣解毒方的藥理功能中發揮著較為重要作用的單體化合物，為后續單體研究抗鼻咽癌功效提供基礎。

GeneCards、GEO、OMIM、PharmGkb、TTD 5 個數據庫中獲取疾病作用靶點3112 個，見圖1A。在應用R 語言軟件Venny R 插件繪制益氣解毒方潛在靶點與鼻咽癌發病機制靶點韋恩圖，共篩選出173個共同靶點，見圖1B。 Cytoscape 軟件構建“藥物活性成分-鼻咽癌靶點調控網絡”。 詳見圖2。

圖1 益氣解毒方-鼻咽癌靶點韋恩圖

圖2 益氣解毒方活性成分－鼻咽癌靶點基因互作網絡

3.2 益氣解毒方治療鼻咽癌的PPI 網絡與關鍵靶點

應用STRING 數據平臺輸入共同靶點名稱，選擇“high confidence：0.95”的模式下構建的PPI 網絡，其節點數為172 個，邊數為625 個，平均節點度為7.27，平均局部聚類系數為0.442，說明益氣解毒方治療鼻咽癌的潛在作用靶點之間富集作用顯著，見圖3。 采用Cytoscape 軟件中的CytoNCA 工具包，連續兩次通過DC、BC、CC、EC、LAC 和NC 進行網絡拓撲屬性篩選，圖4A 中的BC、CC、DC 的平均值參數分別為245.22、0.36、9.61，圖4B 中的BC、CC、DC 的平均值參數分別為540.54、0.43、20.37。 經過兩次過濾后得到4C 圖中的15 個關鍵靶點，為PPI網絡圖中核心基因，其PPI 關系也最直接、最密切。

圖3 共同靶點PPI 網絡圖

圖4 益氣解毒方關鍵節點的網絡拓撲分析圖

3.3 益氣解毒方治療鼻咽癌所涉及的生物功能

GO 分析結果顯示益氣解毒方治療鼻咽癌主要涉及化學應激和活性氧反應等生物過程（biological process, BP），涉及的細胞組成（cellular component,CC）包括膜區、轉錄調節復合體等，影響的分子功能（molecular function, MF）主要集中在DNA 結合轉錄因子結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等方面，結果見圖5A-C；KEGG 分析顯示，益氣解毒方治療鼻咽癌主要富集于PI3K/Akt、MAPK 等信號通路，見圖5D。

圖5 益氣解毒方作用于鼻咽癌的GO 和KEGG 分析

3.4 槲皮素與核心靶蛋白的分子對接

槲皮素度值排名最高，且為黃連、黃芪、白花蛇舌草和甘草共同成分，PI3K/Akt 信號通路中包含的核心靶點大部分為槲皮素的作用靶點，考慮槲皮素為益氣解毒方中最主要的活性化合物，分子對接結果（圖6）顯示，槲皮素與核心靶點TP53、AKT1、MDM2、MYC 均具有良好的結合位點，其最低結合能分別是-9.8l、-10.4、-7.7、-7.8 kcal·mol-1。 根據親和力得分，在分子對接模擬中，槲皮素與AKT1 對接分數最高，對接結果最穩定。

圖6 槲皮素與TP53、AKT1、MDM2、MYC 的分子對接

3.5 益氣解毒方和槲皮素抑制鼻咽癌細胞增殖

與對照組比較，藥物處理24 h 后，1.0、1.5、2.0 g·L-1的益氣解毒方組和40 、60 μmol·L-1的槲皮素組細胞增殖指數顯著降低（P<0.05 或P<0.01）；處理36 h和48 h 后，各濃度益氣解毒方組和槲皮素組，細胞增殖指數均顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。 RTCA 監測結果同樣顯示益氣解毒方和槲皮素能降低細胞增殖指數，兩種方法結果提示益氣解毒方和槲皮素能顯著抑制鼻咽癌細胞增殖。 詳見圖7。

圖7 益氣解毒方和槲皮素對CNE2 細胞增殖的影響

3.6 益氣解毒方和槲皮素抑制鼻咽癌細胞增殖相關蛋白XIAP、PCNA 和Survivin 的表達

與對照組比較，1.0、2.0 g·L-1益氣解毒方和40 μmol·L-1的槲皮素處理36 h 后，CNE-2 細胞增殖細胞蛋白XIAP、PCNA 和Survivin 表達水平均顯著下降（P＜0.05 或P<0.01）；20 μmol·L-1的槲皮素也下調Survivin 蛋白的表達水平（P＜0.05），但順鉑反而上調了Survivin 表達水平（P＜0.05）。詳見圖8。

圖8 益氣解毒方和槲皮素對細胞增殖相關蛋白表達水平的影響

3.7 益氣解毒方和槲皮素下調鼻咽癌細胞PI3K/Akt 信號通路

與對照組比較，1.0、2.0 g·L-1益氣解毒方和20、40 μmol·L-1的槲皮素處理36 h 后，CNE-2 細胞PI3K、AKT1、p-AKT1、mTOR 蛋白表達水平均顯著降低。 詳見圖9。

圖9 益氣解毒方和槲皮素對PI3K/Akt 信號通路關鍵蛋白表達水平的影響

3.8 槲皮素通過PI3K/Akt 信號通路抑制CNE-2 細胞增殖

Western blot 結果（圖10A）顯示，與對照組比較，SC79 2.5 μmol·L-1組能上調PI3K/Akt 信號通路關鍵蛋白PI3K、p-AKT 的同時，也上調了增殖相關蛋白XIAP、PCNA 的表達（P<0.05）；與槲皮素組比較，SC79 2.5 μmol·L-1+槲皮素組可下調PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白PI3K、p-AKT 和增殖相關蛋白XIAP、PCNA 的效應（P<0.05）。

RTCA 及CytationTM5 細胞成像多功能檢測系統監測顯示（圖10B 和圖10C），與對照組比較，SC79 2.5 μmol·L-1組顯著促進鼻咽癌細胞增殖(P<0.05)；LY294002 50 μmol·L-1組可抑制鼻咽癌細胞增殖（P＜0.05）。 與槲皮素組比較，激活PI3K/AKT信號通路后，SC79 2.5 μmol·L-1與槲皮素20 μmol·L-1聯用組可抑制鼻咽癌細胞增殖的效應。

圖10 PI3K/Akt 信號通路在槲皮素抑制CNE-2 細胞增殖中的作用

4 討論

網絡藥理學是臨床醫學、藥理學和生物信息學的交叉學科。 網絡藥理學方法可以通過構建藥物成分網絡和相關靶點模塊，分析中藥方劑的通路和活性成分的分子機制[11-12]。 為了探究益氣解毒方抗鼻咽癌的潛在作用機制，本研究通過網絡藥理學方法建立了益氣解毒方化學成分-靶點網絡、靶點-疾病網絡，預測益氣解毒方治療鼻咽癌的作用機制。 本研究篩選出益氣解毒方的197 種有效單體成分，包括槲皮素、山柰酚、芒柄花黃素、異鼠李素、木犀草素、小檗堿等，上述單體大部分為黃酮類化合物，研究表明，黃酮類化合物可通過調節細胞凋亡、干擾細胞轉導、抑制癌細胞侵襲轉移等多種機制發揮抗腫瘤作用[13]。 如山柰酚作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑誘導細胞發生細胞凋亡、內質網應激、自噬和表觀遺傳修飾[14-15]。 芒柄花黃素近年來被發現對包括鼻咽癌在內的各種癌癥治療有效[16]，與舒尼替尼、表柔比星、多柔比星等化療藥物聯合治療可協同增強化療藥物的抗癌潛力。 小檗堿是中藥黃連中的主要生物堿，可通過干擾細胞周期、誘導細胞凋亡、影響核因子κB 信號通路等途徑抑制腫瘤細胞增殖[17-18]。 在天然植物中尋找有抗腫瘤作用的有效單體成分并探討其作用機制，已成為近年來腫瘤學研究的一大熱點，而網絡藥理學通過高通量篩選及網絡分析技術，對藥物、靶點、疾病之間的復雜生物化學信息進行構架、模擬和分析[19]，篩選藥物作用于疾病的有效物質、作用靶點，幫助發掘化學活性成分，提高新藥研發的成功率[20]。

網絡藥理學通過功能分析，提前預測可能的核心生物學功能和通路，為探究疾病發生的機制和調控關系提供一些參考依據。 KEGG 分析顯示益氣解毒方抗鼻咽癌主要涉及PI3K/Akt、MAPK 等信號通路，已有研究表明，PI3K/Akt 信號通路與鼻咽癌的發生、發展密切相關，能夠增強腫瘤細胞運動能力，促進細胞外基質降解，并誘導血管內皮生長因子的釋放[21]。另外，槲皮素、山柰酚、小檗堿等天然生物活性成分已被研究證實可以通過調節MAPK 信號通路影響癌癥進展[22]，山柰酚可以通過MAPK 和TNF信號通路抑制多種腫瘤細胞的遷移和侵襲，還可通過介導內皮細胞中ERK/p38 和PI3K/AKT 信號通路抑制HIF-1α 和VEGFR2，調節血管的生成[23]。 本研究對核心基因和信號通路分別進行分子虛擬對接和Western blot 驗證，結果表明益氣解毒方和其活性成分槲皮素能調控Survivin、XIAP、PCNA 蛋白和PI3K/Akt 信號通路蛋白的表達，抑制鼻咽癌細胞增殖；通過PI3K/Akt 信號通路激活劑，進一步證明益氣解毒方活性成分槲皮素抑制細胞增殖與下調PI3K/Akt 信號通路密切相關。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學、分子對接技術和體外實驗表明益氣解毒方通過多靶點、多信號通路、多通路發揮抗鼻咽癌效應，其活性成分槲皮素通過下調PI3K/Akt 信號通路抑制鼻咽癌細胞增殖，為益氣解毒方在鼻咽癌臨床治療中的應用提供了依據。